IP(免疫沉淀)技术

一、技术简介：

免疫沉淀(Immunoprecipitation) ，简称IP，是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础用于研究蛋白与蛋白间相互作用的经典方法，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。例如：一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来，进而鉴定这个蛋白复合物中的其他未知蛋白。

二、实验流程：

样本制备-input检测及反馈-免疫沉淀-考马斯亮蓝染色-结果分析。

三、实验步骤： 1.细胞蛋白提取：

1.1 细胞培养（贴壁细胞：100mm细胞培养皿中单层细胞长满80％-90％或者细胞培养瓶中细胞达到2-5×10^7个，悬浮细胞：离心收集细胞，细胞达到2-5×10^7个）；

1.2 加适量预冷的IP细胞裂解液到细胞培养皿中（IP裂解液中加入蛋白酶抑制剂），4℃裂解细胞10min，期间用移液器反复吹打，然后将细胞悬浮液转移到1.5ml离心管中，继续冰上裂解20min；

1.3 12000rpm、4℃离心10min，将上清转入新的1.5ml离心管中，冰上操作，然后采用BCA法测定蛋白浓度；

1.4 取少量上清液变性后用于input实验，即WB检测靶蛋白。

2.组织蛋白提取：

2.1 组织块用预冷的PBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆管中，加入10倍组织体积IP裂解液（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），机器匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该IP裂解液体积；

2.2 将匀浆液转移至1.5ml离心管中，冰上裂解30min；

2.3 12000rpm，4℃，离心10min，收集上清，然后采用BCA法测定蛋白浓度；

2.4 取少量上清液变性后用于input实验，即WB检测靶蛋白。

3.免疫沉淀步骤：

3.1 向阴性对照（IgG）组别蛋白上清液中加入1.0μg IgG（与IP实验用于沉淀的抗体种属来源相同的普通IgG）和20μL protein A/G珠子（使用前充分混匀）,实验组别直接加入20μL protein A/G珠子，4℃摇转孵育1h；

3.2 2000g，4℃，离心5min，取上清；

3.4 加入1-10μL（0.2-2μg）抗体，然后4℃孵育过夜；

3.5 加入80μL protein A/G-珠子（使用前充分混匀），用手指轻轻弹匀，4℃孵育2h；

3.6 4℃，2000g，离心5min，小心吸去上清，注意不要吸到底部的珠子，收集免疫沉淀复合物；

3.7 将免疫沉淀复合物用1ml预冷的IP裂解液（不用加各种抑制剂）洗涤4次，每次4℃，2000g，离心5min，每次洗涤小心弃去上清；

3.8 洗涤之后，尽可能的吸去上清液，然后,加入80μL 1×还原型上样缓冲液，沸水煮10min， 4℃，1000g，离心5min取上清。

4. 检测：

4.1 取50μL上清样品用于SDS-PAGE检测；

4.2 考马斯亮蓝染色后切胶回收蛋白，做质谱检测鉴定。

四、IP-考染结果图：

五、送样运输要求： 1. 新鲜组织，100mg以上，干冰运输。 2. 细胞要求10^7以上，收集细胞沉淀，干冰运输。 3. 抗体要求为IP级别。