pCMV-N-mito-Flag-APEX2 (线粒体邻近蛋

产品简介：
pCMV-N-mito-Flag-APEX2 (线粒体邻近蛋白生物素标记质粒)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中表达N端融合线粒体基质定位肽(Mitochondrial matrix target peptide, mito)、Flag标签和APEX2的目的蛋白以用于生物素标记与其相互作用的目的蛋白的质粒。在H₂O₂存在的情况下，APEX2在1分钟内能快速将生物素基酪氨酰胺(Biotin-tyramide, Biotin-phenol)、生物素-4-氨基本酚(Biotin-4-aminophenol)或生物素-萘胺(Biotin-naphthylamine, Biotin-nap)转化为自由基，这些自由基可以标记20nm半径内无论是直接相互作用的蛋白还是邻近的蛋白任意暴露在外富含电子的氨基酸残基(Tyr, Trp, Cys or His)，后续可通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白，并通过质谱(Mass spectrometry, MS)鉴定相互作用的蛋白(图1)。线粒体邻近蛋白生物素标记质粒在筛选和鉴定线粒体内的蛋白与蛋白相互作用和探索相关功能方面发挥着至关重要的作用[1]。

图1. 碧云天线粒体邻近蛋白生物素标记质粒pCMV-N-mito-Flag-APEX2的工作原理图。

APEX (Ascorbate peroxidase)是基于来源于豌豆(Pea)或大豆(Soybean)的抗坏血酸过氧化物酶经人工改造获得的新型抗坏血酸过氧化物酶。目前被广泛应用的HRP (Horseradish peroxidase) ，中文名为辣根过氧化物酶，也常应用于邻近蛋白生物素标记和电子显微镜细胞成像。APEX和HRP相比的优点有：①APEX在细胞质中具有酶活性：HRP在细胞质中不具有酶活性，因为在细胞质的还原性环境中HRP的4对二硫键无法形成，而且细胞质中钙离子稀少导致HRP的2个Ca²⁺结合位点空缺，所以HRP只能标记细胞膜外的蛋白，细胞膜内只能标记线粒体、内质网内的蛋白，但是APEX的酶活性不受这些因素限制，APEX可以标记细胞质中的蛋白质。②更好的标记效果：HRP分子量约44kDa，而APEX分子量仅约27kDa，因此APEX对融合蛋白功能的影响更小，空间位阻也更小，更容易接近被标记蛋白并产生更好的标记效果。③反应速度快：在H₂O₂的催化下APEX可以在1分钟内完成对邻近蛋白的生物素标记，因此APEX可以检测、研究细胞不同时间段“瞬间”的蛋白质间相互作用[2]。

本产品中采用的APEX2是APEX的改进增强版本。APEX2和APEX相比的优点有：①蛋白表达量高：APEX2在哺乳细胞中稳定性更好，因此融合蛋白表达量更高。②酶活性更高：APEX2的酶活性更高，因此可以在融合蛋白表达量较低的情况下更有效的进行邻近蛋白生物素标记和电子显微镜细胞成像[3]。

APEX也常被用于电子显微镜细胞成像(Electron microscopy, EM)，因此也被称作EM标签(EM tag)，其原理是表达APEX融合蛋白的细胞被固定后，加入DAB (3,3'-Diaminobenzidine)底物，在H₂O₂存在的情况下，APEX催化DAB氧化聚合交联生成局部沉淀，后续用富含密集电子的OsO₄对DAB聚合物进行染色产生EM对比，后续用电子显微镜进行成像(图2) [4]。

图2. 碧云天APEX2融合蛋白用于电子显微镜细胞成像(Electron microscopy, EM) 的工作原理图。

碧云天各种邻近蛋白生物素标记质粒的比较和选择

本质粒含有CMV启动子，可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达；线粒体基质定位肽(Mitochondrial matrix target peptide)辅助表达的融合蛋白进入线粒体中，表达的融合蛋白带有3X Flag标签便于检测；带有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性和新霉素(Neomycin)抗性，可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌；转染哺乳动物细胞后，可使用G418 (ST081)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株，G418和新霉素效果一致，但G418的细胞毒性更低。

pCMV-N-mito-Flag-APEX2质粒(6329bp)的图谱如下：

pCMV-N-mito-Flag-APEX2质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	235-818
mito, mitochondrial matrix target peptide	923-997
3X Flag Tag	1004-1069
APEX2	1076-1822
3X GGGGS repeats linker	1823-1867
Multiple Cloning Sites	1868-1909
BGH poly(A) signal	1929-2153
f1 ori	2199-2627
SV40 promoter	2641-2970
Neomycin resistance gene	3037-3831
SV40 poly(A) signal	4005-4126
lac operator	4199-4215
CAP binding site	4268-4289
ori	4577-5162
Ampicillin resistance gene	5333-6193
Ampicillin promoter	6194-6298

pCMV-N-mito-Flag-APEX2表达基因的详细图谱见说明书

pCMV-N-mito-Flag-APEX2中没有的酶切位点包括：

AarI	AbsI	AccIII	AccB7I	AcvI	AjiI	AjuI
Aor13HI	AscI	AsiSI	BaeI	BanIII	BarI	BbrPI
BlpI	BmgBI	BoxI	Bpu1102I	Bsa29I	B-seAI	B-seCI
BshVI	BsiWI	BsmBI	Bsp13I	Bsp1407I	Bsp1720I	BspDI
BspEI	BspXI	BsrGI	BstAUI	BstEII	BstENI	BstHPI
BstPI	BstPAI	Bsu15I	BsuTUI	BtrI	CciNI	CelII
Cfr42I	ClaI	Eco72I	Eco91I	EcoNI	EcoO65I	Esp3I
FseI	FspAI	HpaI	I-CeuI	I-PpoI	I-SceI	Kpn2I
KspI	KspAI	MauBI	MreI	MroI	NotI	PacI
PalAI	PaqCI	PasI	Pfl23II	PflMI	PI-PspI	PI-SceI
PmaCI	PmlI	PshAI	PspCI	PspEI	PspLI	PsrI
RgaI	RigI	SacII	SbfI	SdaI	SfaAI	SfiI
Sfr303I	SgfI	SgrAI	SgrBI	SgsI	SmiI	SrfI
Sse8387I	SspBI	SstII	SwaI	Van91I	XagI	XcmI

pCMV-N-mito-Flag-APEX2中的单酶切位点包括：

AfeI	AflII	AgeI	AhdI	ApaI	AvrII	BamHI
BbvCI	BmtI	BsaBI	BsgI	BstBI	BstZ17I	Bsu36I
DraIII	EagI	Eco53kI	EcoRI	HindIII	KasI	KflI
KpnI	MfeI	MluI	NarI	NdeI	NheI	NruI
PciI	PflFI	PfoI	PluTI	PpuMI	PstI	PvuI
RsrII	SacI	ScaI	SexAI	SfoI	SgrDI	SmaI
SnaBI	SpeI	SspI	StuI	TspMI	Tth111I	XbaI
XhoI	XmaI

pCMV-N-mito-Flag-APEX2质粒中推荐使用的测序引物序列如下：

CMV-F (769-789): 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'

BGH-R (1940-1923): 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3'

pCMV-N-mito-Flag-APEX2的全序列信息:D3047 pCMV-N-mito-Flag-APEX2-全长序列.txt。

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。