酵母菌落PCR试剂盒(碱裂解法)

产品简介：
碧云天生产的酵母菌落PCR试剂盒(碱裂解法)，英文名为Yeast Colony PCR Kit by Alkaline Lysis，是一种非常便捷的用于酿酒酵母、毕赤酵母等菌株在质粒转化后阳性克隆菌落的PCR筛选和鉴定的试剂盒。

本试剂盒提供了Yeast Lysis Buffer用于破坏酵母细胞壁，并提供了Yeast Colony PCR Mix (Green, 2X)用于进行PCR扩增。Yeast Colony PCR Mix (Green, 2X)是含有蓝色和橙色染料(电泳位置分别约4kb和50bp)的2倍浓度的PCR预混液，含有2X Taq DNA Polymerase、2X PCR Buffer、2X dNTP和2X Loading Buffer等，用户只需加入酵母菌落裂解液、引物和水即可进行PCR扩增，并且扩增完毕后可以直接上样电泳。

酵母是一种经典的真菌模式生物，被广泛用于细胞生物学、遗传学、衰老等方面的研究。同时酵母作为真核生物具有较快的生长速度、成熟的翻译后修饰系统和抗性筛选系统，在分子生物学研究中常常被用作动植物蛋白表达和互作的异源宿主检测系统。在酵母中进行基因操作时，为确保其准确性，需对DNA片段的引入或删除进行鉴定，常规步骤包括单菌落扩增培养、收集并裂解细胞、提取高纯度DNA模板及PCR检测[1]，在进行大规模筛选工作时，该方法往往成本高且效率低。菌落PCR无需预先分离或纯化DNA，而是直接以菌体或菌体裂解液为模板来完成靶标序列的扩增，相对而言比较快速高效。

酵母细胞的细胞壁主要成分为多糖(85%-90%)和蛋白质(10%-15%)，其中多糖是由甘露聚糖、β-葡聚糖和少量的几丁质等组成，处于细胞壁内层的β-葡聚糖与几丁质共价相连，起到细胞骨架的作用；而外层的甘露聚糖与中层蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸以O-糖苷键相连接，形成的甘露糖蛋白覆盖于细胞表面，给予酵母细胞一定的韧性[2]。酵母细胞壁独特的结构致使其DNA难以被简单的PCR加热过程所释放，导致很多将酵母直接作为模板进行PCR检测的试剂盒成功率都比较低。

本试剂盒提供了Yeast Lysis Buffer在PCR反应前对酵母进行有效预处理，可以充分释放酵母DNA，能确保有效进行酵母菌落PCR，从而大大缩短酵母转化后阳性克隆鉴定的时间，提高实验效率。

本试剂盒使用非常便捷。本试剂盒中提供的Yeast Colony PCR Mix (Green, 2X)已经含有所有的通用组分，用户只需自备引物和水即可对酵母菌落进行PCR扩增。它大大简化了PCR操作，使操作更加快捷，也减少了PCR操作过程中可能导致的污染，使PCR的重复性更好；同时Yeast Colony PCR Mix (Green, 2X)中已经包含了上样缓冲液组分，PCR扩增结束后即可直接上样电泳，无需添加上样缓冲液。

本试剂盒中提供了双色染料，便于电泳时观察电泳进程。本试剂盒中的Yeast Colony PCR Mix (Green, 2X)加入了蓝色和橙色的电泳示踪染料(整体呈现绿色)，其在浓度为1%琼脂糖胶中的迁移位置分别大约位于4kb和50bp处。PCR结束后可直接进行电泳检测，无需再添加上样缓冲液。蓝色和橙色示踪染料不会影响对相应DNA条带的观察和检测。

本产品稳定性高。经测试，本试剂盒中的PCR mix反复冻融15次后对PCR的扩增效果无显著影响。

使用本试剂盒对毕赤酵母菌落检测效果请参考图1。

图1.碧云天D7278 酵母菌落PCR试剂盒(碱裂解法)对于毕赤酵母菌落的检测效果图。A. 使用碧云天毕赤酵母感受态细胞制备及转化试剂盒(D0308)制备的毕赤酵母KM71感受态细胞转化带有目的基因的pAOX1-MCS-His-Zeocin载体(D2881)培养72小时的平板。B. 图A中的菌落使用碧云天D7278 酵母菌落PCR试剂盒(碱裂解法)进行菌落PCR后的电泳图。用无菌吸头挑取0.2-1mm酵母单克隆菌落至含10µl Yeast Lysis Buffer的PCR八联排管(0.2ml, 凸盖, 透明) (FTUB328)中，混匀，随后在PCR仪上95℃处理5分钟，再加入10µl Neutralization Buffer，混匀后快速离心一下，随后取1µl菌液作为PCR模板，进行菌落PCR检测。PCR反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分30秒，30个循环；72℃ 10分钟，4℃ forever。1368bp是目的基因片段的扩增条带。M，DNA Ladder (D0110)。1-10，实验组(PCR模板为酵母单菌落裂解后的菌液)，-，阴性对照。本产品的实际使用效果会因实验条件、实验材料等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

使用本试剂盒对酿酒酵母菌落检测效果请参考图2。

图2.碧云天D7278 酵母菌落PCR试剂盒(碱裂解法)对于酿酒酵母菌落的检测效果图。A. 使用碧云天酿酒酵母感受态细胞制备及转化试剂盒(D0310)制备的酿酒酵母INVSc1感受态细胞转化pGAL1,10-α factor-His-Flag-URA载体(D2892)培养48小时的平板。B. 图A中的菌落使用碧云天D7278 酵母菌落PCR试剂盒(碱裂解法)进行菌落PCR后的电泳图。用无菌吸头挑取0.2-1mm酵母单克隆菌落至含10µl Yeast Lysis Buffer的PCR八联排管(0.2ml, 凸盖, 透明) (FTUB328)中，混匀，随后在PCR仪上95℃处理5分钟，再加入10µl Neutralization Buffer，混匀后快速离心一下，随后取1µl菌液作为PCR模板，进行菌落PCR检测。PCR反应条件：94℃ 3分钟；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 40秒，30个循环；72℃ 10分钟，4℃ forever。561bp是目的基因片段的扩增条带。M，DNA Ladder (D0110)。1-10，实验组(PCR模板为酵母单菌落裂解后的菌液)；-，阴性对照。本产品的实际使用效果会因实验条件、实验材料等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

本试剂盒如果用于20微升的PCR反应体系，小包装足够用于100个菌落的检测，中包装足够用于500个菌落的检测。

保存条件：

-20℃保存，至少一年有效。Yeast Lysis Buffer和Neutralization Buffer可以室温或4℃保存，至少一年有效。Yeast Colony PCR Mix (Green, 2X)尽量避免反复冻融。

注意事项：

酵母菌落较难裂解，裂解时请注意吹打混匀或Vortex震荡混匀。

由于PCR反应非常灵敏，可使目的基因扩增超过1000万倍，在设置PCR反应时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。

尽管本产品经过15次反复冻融后仍具有和冻融前几乎相同的PCR扩增效果，但仍宜适当避免反复冻融本产品，多次反复冻融可能使产品性能下降。

使用本产品前，一定要完全融化，并上下颠倒轻轻混匀后才能使用，并尽量避免产生气泡。

超纯水推荐选购ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。