检测实验丨线粒体DNA损伤检测

线粒体DNA损伤检测

线粒体DNA（Mitochondrial DNA，简称mtDNA）是线粒体中的遗传物质，mtDNA的完整性对于线粒体的正常功能和细胞的能量代谢至关重要。

然而，在生命活动中，mtDNA容易受到内源性（如氧化自由基、复制错误）和外源性（如电离辐射、化学毒物）因素的影响而发生损伤，这种损伤可能导致线粒体功能障碍，进而引发一系列疾病，如帕金森病等。

一、原理：

QPCR（定量聚合酶链式反应）检测线粒体DNA（mtDNA）损伤主要基于实时荧光定量PCR技术。这一技术结合了PCR的DNA扩增能力和荧光信号的实时监测，从而实现对mtDNA损伤的高灵敏度、高特异性检测。

当mtDNA发生损伤时，如DNA链断裂、碱基修饰等，这些损伤会影响PCR扩增的效率或特异性。通过监测QPCR反应中的荧光信号变化，可以间接反映mtDNA的损伤情况。例如，如果mtDNA发生严重损伤，那么PCR扩增产物的量会减少，从而导致荧光信号减弱。

二、材料与仪器：

移液器、低温高速离心机、实时定量PCR仪、普通PCR仪、高速低温组织研磨仪、紫外分光光度计、水浴锅、漩涡混匀器

三、实验步骤：

一、组织细胞mtDNA制备

1、组织匀浆与线粒体提取：

取肾组织（150mg），加入9倍体积的生理盐水。剪碎组织后，置于匀浆仪中匀浆。在4℃台式离心机中以2000rpm离心10min，弃沉淀。取上清以10000rpm离心15min，沉淀即为线粒体。

2、线粒体DNA释放：

向线粒体中加入200μl溶液A，振荡至彻底混匀。加入20μl的RNase A (10mg/ml)，55℃放置15min。加入20μl的蛋白酶K (10mg/ml)，55℃水浴消化3h，期间颠倒混匀数次直至样品消化完全（液体清亮及粘稠）。

3、DNA纯化：

加入200μl溶液B，充分颠倒混匀。加入200μl无水乙醇，充分混匀。12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600μl漂洗液（已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，重复此步骤一次。12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟。将吸附柱放入干净离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200μl经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心2min。可将离心所得洗脱液再次加入吸附柱中，12000rpm离心2min，收集mtDNA。

4、浓度计算：

使用分光光度计测量OD260值，计算mtDNA浓度：mtDNA浓度(ng/μl) = OD260 × 50 × 稀释倍数。

二、超长延展PCR扩增反应

1、PCR反应体系配制

长扩液 (reagent A) 30μl

mtDNA样品 20ng

补充液(reagent D) 补齐至50μl

2、PCR反应条件

94℃ 2min（1循环）

94℃ 15s → 64℃ 12min（10循环）

94℃ 15s → 68℃ 12min（10循环）

72℃ 10min

3、产物浓度计算

测量PCR产物的OD260和OD280值，计算扩增产物浓度和总量。

三、标化荧光定量扩增反应

1、PCR反应体系配制

标化液 (reagent B) 30μl

mtDNA样品 20ng

染色液（reagent C）5μl

补充液(reagent D) 补齐至50μl

2、PCR反应条件

50℃ 2min（1循环）

95℃ 10min（1循环）

95℃ 15s → 60℃ 1min（40循环）

3、数据采集与分析

扩增片段为108bp（线粒体ND1基因小片段），采集数据并进行熔解曲线分析。

四、DNA损伤程度计算

1、计算公式：
DNA损伤程度 = 1 - {【DNA总量（样品超长片段）÷Ct（样品标化片段）】÷【DNA总量（对照超长片段）÷Ct（对照标化片段）】}

※损伤程度定义为相对于正常对照样品的DNA损伤水平，以0至1的损伤系数表示，系数越大，损伤越严重。

四、注意事项

1、引物设计：

设计的引物应具有高度的特异性和扩增效率。

避免引物自身及引物之间形成连续4个碱基的互补，以免产生非特异性扩增。

2、反应体系配置：

精确称量和加样，确保各组分浓度的准确性。使用高质量的试剂和耗材，以减少实验误差。

3、PCR扩增：

设置合理的反应程序和条件，注意退火温度和时间等。

4、结果分析：

根据实验需求选择合适的定量分析方法。仔细分析熔解曲线，确认扩增的特异性。