pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo

产品简介：
pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达N端带有HA标签(HA tag, YPYDVPDYA)的目的蛋白、增强绿色荧光蛋白EGFP和新霉素(Neomycin)抗性基因的表达质粒。

本质粒含有的CMV启动子可以高效启动目的基因的表达；可以方便地使用抗HA标签的抗体(AF5057/AF2305/AF0039)来检测目的蛋白；同时可以通过P2A共表达增强绿色荧光蛋白EGFP，便于通过EGFP的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1

图1. 碧云天pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片，右侧为荧光照片。本图仅供参考，实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。

本质粒在多克隆位点和EGFP的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切，而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG)，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列，可提高剪切效率 [1,2]。

本质粒为卡那霉素(Kanamycin)和新霉素(Neomycin)抗性。可利用其卡那霉素抗性，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后，可使用G-418 (ST081/ST082)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV enhancer	67-370
CMV promoter	371-574
T3 promoter	620-638
HA	679-705
P2A	775-840
EGFP	841-1560
T7 promoter	1612-1630
SV40 poly(A) signal	1904-2025
f1 ori	2032-2487
AmpR promoter	2514-2618
SV40 promoter	2620-2977
SV40 ori	2828-2963
NeoR/KanR	3012-3806
HSV TK poly(A) signal	4038-4085
ori	4414-5002

pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒(5110bp)的图谱如下：

pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo的多克隆位点的详细图谱如下

pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo中没有的酶切位点包括：

AarI	AbsI	AccIII	Acc113I	AccB7I	AclI	AcvI
AfeI	AflII	AgeI	AhdI	Aor13HI	Aor51HI	AscI
AsiGI	AsiSI	Asp700I	AspEI	BaeI	BbrPI	BbsI
BbvCI	BfrI	BlpI	BmcAI	BmeRI	BoxI	BpiI
Bpu1102I	BpuAI	BseAI	BsePI	BshTI	BsiWI	Bsp13I
Bsp68I	Bsp1720I	BspEI	BspQI	BspTI	BssHII	BssNAI
Bst6I	Bst98I	Bst1107I	BstAFI	BstEII	BstENI	BstPI
BstPAI	BstV2I	BstZ17I	BtuMI	CelII	CspAI	DriI
Eam1104I	Eam1105I	EarI	Eco47III	Eco72I	Eco91I	EcoNI
EcoO65I	FseI	FspAI	I-CeuI	I-PpoI	I-SceI	Kpn2I
Ksp632I	LguI	MauBI	MreI	MroI	MroXI	MspCI
MssI	NruI	PalAI	PauI	PciSI	PdmI	Pfl23II
PflMI	PI-PspI	PI-SceI	PinAI	PmaCI	PmeI	PmlI
PpuMI	PshAI	Psp5II	Psp1406I	PspCI	PspEI	PspLI
PspPPI	PspXI	PsrI	RgaI	RigI	SanDI	SapI
SbfI	ScaI	SdaI	SfaAI	SgfI	SgrAI	SgrDI
SgsI	SmiI	Sse8387I	SwaI	Van91I	Vha464I	XagI
XcmI	XmnI	ZrmI

pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo中的单酶切位点包括：

AccI	GT`MK,AC	746	MscI	TGG|CCA	3222
ApaI	G,GGCC`C	1565	NarI	GG`CG,CC	3140
ApaLI	G`TGCA,C	4744	NdeI	CA`TA,TG	240
BamHI	G`GATC,C	715	NotI	GC`GGCC,GC	668
BcgI	,NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN`	931	PaeR7I	C`TCGA,G	757
BclI	T`GATC,A	1797	PciI	A`CATG,T	5058
BglII	A`GATC,T	751	PflFI	GACN`N,NGTC	3258
BmgBI	CAC|GTC	819	PluTI	G,GCGC`C	3143
BsaI	GGTCTCN`NNNN,	4129	PspOMI	G`GGCC,C	1561
BsaXI	,NNN`(N)9ACNNNNNCTCC(N)7,NNN`	2190	PstI	C,TGCA`G	731
BsmBI	CGTCTCN`NNNN,	809	PvuI	CG,AT`CG	1643
BspDI	AT`CG,AT	2980	RsrII	CG`GWC,CG	3656
BsrDI	GCAATG,NN`	3373	SacI	G,AGCT`C	655
BsrGI	T`GTAC,A	1550	SacII	CC,GC`GG	662
BstBI	TT`CG,AA	3822	SalI	G`TCGA,C	745
BstXI	CCAN,NNNN`NTGG	663	SfiI	GGCCN,NNN`NGGCC	2915
ClaI	AT`CG,AT	2980	SfoI	GGC|GCC	3141
CspCI	,NN`(N)11CAANNNNNGTGG(N)10,NN`	382	SmaI	CCC|GGG	710
DraIII	CAC,NNN`GTG	2256	SnaBI	TAC|GTA	346
Eco53kI	GAG|CTC	653	SpeI	A`CTAG,T	769
EcoRI	G`AATT,C	733	SrfI	GCCC|GGGC	710
EcoRV	GAT|ATC	741	StuI	AGG|CCT	2961
Esp3I	CGTCTCN`NNNN,	809	TspMI	C`CCGG,G	708
HindIII	A`AGCT,T	721	Tth111I	GACN`N,NGTC	3258
HpaI	GTT|AAC	1903	XbaI	T`CTAG,A	763
KasI	G`GCGC,C	3139	XhoI	C`TCGA,G	757
MfeI	C`AATT,G	1890	XmaI	C`CCGG,G	708
MluI	A`CGCG,T	2026

pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo质粒中对于插入片段进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物EGFP primer的序列如下：

T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'

EGFP primer (843-859): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'

pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo的全序列信息：D2734 pCMV-N-HA-MCS-P2A-EGFP-Neo 全序列.txt

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。