糖化酶(Glucoamylase)试剂盒

牛微精蛋白β(MSMβ) ELISA 试剂盒
 ELISA试剂盒的那点儿事

     酶联免疫吸附测定，又称酶联免疫吸附试验，即ELISA，是酶免疫测定技术中应用最广的技术。1971年Engvall等人发表了使用ELISA定量测定IgG的文章，将1966年用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
 
ELISA的原理
     ELISA原理是将抗原或抗体包被在固相载体

糖化酶(Glucoamylase)试剂盒说明书

微量法100T/48S

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），又称γ-淀粉酶，是一种外切型糖苷酶，它从淀粉的非还原性末端水解α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键，将淀粉完全水解为葡萄糖，因此广泛的应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中，是我国重要的工业酶制剂之一。

测定原理

糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖，与3,5-二硝基水杨酸生成红棕色化合物，在540nm处有最大光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与葡萄糖的量成正比，可测定计算得糖化酶的活力。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

酶液提取

1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 培养液或其它液体：直接检测。

测定操作

	对照管	测定管
样本（μL）		10
灭活样本（μL）	10
试剂一（μL）	100	100
充分混匀，40℃反应20min
试剂二（μL）	90	90
混匀，沸水浴5min，自来水冷却后，于微量石英比色皿/96孔板，蒸馏水调零，测定540nm处吸光值A，△A=A测定管-A对照管

酶活性计算公式

标准曲线：y = 0.2164x - 0.0182，R² = 0.9992 

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 按照蛋白含量计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每毫克蛋白每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/mg prot）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反总÷（V样×Cpr）÷T

                        = 2.54×（△A+0.0182）÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每克组织每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/g）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T

= 2.54×（△A+0.0182）÷ W

3. 按照液体体积计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每毫升培养液每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/mL）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反总÷V样÷T

                  = 2.54×（△A+0.0182）

4. 按照细胞数量计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每10⁴个细胞每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/10⁴cell）=（△A+0.0182）÷ 0.2164×V反总÷（V样×细胞数量（万个）÷V样总）÷T

                      = 2.54×（△A+0.0182）÷ 细胞数量（万个）

V反总：反应总体积，0.11mL，V样：反应体系中加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，20min

b. 用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.1082x - 0.0182，R² = 0.9992 

1. 按照蛋白含量计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每毫克蛋白每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/mg prot）=（△A+0.0182）÷ 0.1082×V反总÷（V样×Cpr）÷T

                        = 5.08×（△A+0.0182）÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每克组织每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/g）=（△A+0.0182）÷ 0.1082×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T

 = 5.08×（△A+0.0182）÷ W

3. 按照液体体积计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每毫升培养液每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/mL）=（△A+0.0182）÷ 0.1082×V反总÷V样÷T

            = 5.08×（△A+0.0182）

4. 按照细胞数量计算

酶活性定义：在40℃，pH4.6条件下，每10⁴个细胞每分钟分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

糖化酶活性（U/10⁴cell）=（△A+0.0182）÷ 0.1082×V反总÷（V样×细胞数量（万个）÷V样总）÷T

                                         = 5.08×（△A+0.0182）÷ 细胞数量（万个）

V反总：反应总体积，0.11mL，V样：反应体系中加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，20min

注意事项

1. 灭活样本的制备建议将样本放在沸水浴中煮沸10min，以将酶彻底灭活。

2. 测定之前进行预实验，若吸光值较高，请将样品用提取液进行适当的稀释再测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

 

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上，利用抗原抗体特异性结合，检测过程中，通常使用洗板的方式去除非结合物，最终酶促反应后的底物的颜色，对样本中蛋白进行定性与定量。
 
 ELISA常见主要试剂
1、抗体：单抗特异性强，多抗结合性高，高端试剂盒需要高效的配对。
2、抗原：大多为重组蛋白,细胞因子和待测样本，高效标准品需NIBSC/WHO校准。
3、显色作用体系：首先辣根过氧化物酶（HRP）与常见底物TMB和OPD均可形成显色体系，再者碱性磷酸酶(AP)的底物为对-磷酸酯可形成黄色底物，还有葡萄糖氧化酶（GOD）的葡萄糖氧化酶法形成特殊显色，最后β-D-半乳糖苷（β-D-Gal）的底物为4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）可生成高强度荧光。

 ELISA的类型 
根据试剂的来源和样本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法，按照原理及操作，市面最常用的方法有：
 
   1.间接法ELISA
是检测抗体最常用的方法，原理为利用酶标记的二抗以检测已与固相结合的受检抗体，显色测定。优势在于待测一抗无需标记快速便捷。直接法ELISA与间接法ELISA相似，区别在于一抗酶标，检测孵育也以抗原为主，但直接法ELISA的灵敏度有限，需权衡使用。

 2.夹心法ELISA
又分为双抗原夹心法和双抗体夹心法ELISA，原理相似，用于检测抗体或抗原含量。以双抗体夹心法为例，捕获抗体包被在固相载体上，加入抗原或待测样本结合，后加入的检测抗体结合在抗原上，形成三明治夹心形式。双抗夹心法是市面最常见与方便分析的方法。

3.竞争法ELISA
小分子抗原与半抗原的检测方法常用竞争法ELISA，待检样本中抗原越多，被结合的酶标抗原的量会减少，彼此形成竞争负相关体系，显色物质也就越少，根据显色物质的比例可拟合得到待测抗原含量。

 4.其他方法
a.免疫抑制法测ELISA：固相包被抗原，被检样本对底物显色的抑制程度与样本中所含抗原的量成正比，二者之差为待测抗原含量，原理类似与竞争法ELISA。
b.阻断ELISA：目的检测特异性抗体，也称为竞争ELISA，原理为固相包被抗原，待测样本与一抗酶标竞争孵育，待检样本中抗体越多，显色越浅，反则反之。非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中涉及该法。
c.此外有用于检测IgM抗体的抗体捕捉ELISA，有固相载体改变的Dot-ELISA（硝酸纤维素膜）和C-ELISA（涤纶布），还有技术分类的TRFIA和多因子检测等。

 
ELISA的评估 
ELISA Kit的多指标决定了产品质量的优劣，优秀的试剂盒需要对如下6大项指标进行测定评估，分析如下：
   1、准确性
ELISA Kit的多指标决定了产品质量的优劣，优秀的试剂盒需要对如下6大项指标进行测定评估，分析如下：
a.回收率：测定试剂盒对数据真实性的校准，过高或偏低会产生加样和假性性的失准数据。
b.线性：测定试剂盒稀释液与样本微环境的的准确性，过高或偏低均会出现测定的偏差。
 
   2、精确度
a.板内精确度：评价单次实验中，同一个已知浓度不同复孔的差异。
b.板间精确度：评价同一样本，多次实验的差异。
 
   3、精密度
最低检测限：能显著区分空白信号的最小信号值对应的最低浓度，用于评估试剂盒的灵敏度，值越低试剂盒灵敏度越高。
 
   4、特异性
a.交叉反应：评判特异性，不同分子与试剂盒抗体结合能力，交叉反应越大，特异性越差。
b.抗干扰能力：同源物的干扰，内源性物质对检测系统的干扰。
 
   5.天然样本检测性
对天然样本及合适的样本类型检测分析。对天然样本类型确定，避免假阳性或假阴性结果。
 
   6、稳定性
试剂盒时效性和稳定性是对指标检测的重要保障。稳定性越高，试剂盒存储时间越久。

 ELISA的应用 
ELISA技术是特定靶标蛋白质定量的金标准，提供快速，稳定且易于分析的结果。可以对生物大分子/小分子的定量，对亲和力测定评价或者筛选，还可对重组蛋白或细胞因子进行活性比对分析等运用。常应用于细胞因子，趋化因子，生长因子等检测，同时应用于癌症、干细胞、免疫学、神经学和信号转导等研究领域的靶标。

牛微精蛋白β(MSMβ) ELISA 试剂盒  

ELISA实验所用试剂-酶的底物与最后步骤详解介绍！

1，酶的底物

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HRP的底物

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HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O
　　上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。

      OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水，OPD·2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性，操作时应予注意。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂盒中，OPD和H2O2一般分成二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用液。
TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。
      ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。
      另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，经HRP作用后，产物显荧光，可用荧光光度计测量。用于ELISA的优点为可加宽定量测定的线性范围。
HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。H2O2应用最多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较H2O2方便、稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后，在底物缓冲液中密闭、低温（2～8℃）可稳定1年。

 

1、AP的底物


      AP为磷酸酯酶，一般采用对磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-)作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。
2，洗涤液
　　在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。
3，　酶反应终止液
　　常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。 
4，阳性对照品和阴性对照品
　　阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血甭较难得到，国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆(recalcified human plasma)为原料，即在血浆中加入钙离子，使其中的纤维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似。阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。
      例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称，在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml，阳性对照品中含量约为10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。
5，参考标准品
　　定量测定的ELISA试剂盒（例如甲胎蛋白质癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。