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- DUMABIO
- DM-P4501005
- 上海
- 2025年12月18日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保质期：
6个月
- 保存条件：
2-8°
- 供应商：
上海笃玛生物科技有限公司
- 库存：
999
- 规格：
100管/48样
苯胺-4-羟化酶（AH）活性测定试剂盒说明书
微量法 100管/48样
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。AH在P450酶系中相当于CYP2E1亚型，CYP2E1不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。
测定原理：
AH催化苯胺羟化后产生的4-氨基酚，进一步转变为酚-吲哚复合物，在630nm处有特征吸收峰；通过测定630nm吸光度增加速率，来计算AH活性。
自备仪器及用品：
普通离心机、超速离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、双蒸水和冰。
试剂组成和配制：
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入100mL蒸馏水，充分溶解。
试剂二：液体×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入10mL蒸馏水，充分溶解。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5mL蒸馏水，充分溶解。
试剂五：液体×1瓶，4℃保存。
试剂六：粉剂×1瓶（腐蚀性试剂），4℃避光保存。临用前加入10mL蒸馏水，充分溶解。
试剂七：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入10mL蒸馏水充分溶解。
标准液：液体×1瓶，10μmol/L，4℃避光保存。
粗酶液提取：
1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃，离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。
2、粗制微粒体： 100 000g 4℃，离心60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。
4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到630 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三置于37℃水浴中预热30min。
3. 试剂五置于冰浴预冷30min。
4. 标准管：取0.5 mL EP管，加入100μL标准液，100μL试剂六，100μL试剂七，混匀后室温静置30min，吸取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，630 nm测定光吸收，记为A标准管。
5. 对照管：取0.5 mL EP管，加入50μL粗酶液，100μL试剂三，50μL蒸馏水，混匀后37℃水浴中保温30min；再加入100μL试剂五，混匀后冰浴5min，11000rpm，4℃，离心10min；取100μL上清液，加入新的0.5 mL EP管；再加入100μL试剂六，100μL试剂七，混匀后室温静置30min，吸取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，630 nm测定光吸收，记为A对照管。
6. 测定管：取0.5 mL EP管，加入50μL粗酶液，100μL试剂三，50μL试剂四，混匀后37℃水浴中保温30min；再加入100μL试剂五，混匀后冰浴5min，11000rpm，4℃，离心10min；取100μL上清液，加入新的0.5 mL EP管；再加入100μL试剂六，100μL试剂七，混匀后室温静置30min，吸取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，630 nm测定光吸收，记为A测定管。
AH活性计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol 4-氨基酚为1个酶活单位。
AH活性(nmol/min/mg prot) = C标准品×V标准品×（A测定管－A对照管）÷A标准管×稀释倍数÷（Cpr×V样）÷T
= 2×（A测定管－A对照管）÷A标准管÷Cpr。
（2）按样本质量计算
活性单位定义：37℃中每克样本每分钟催化产生1nmol 4-氨基酚为1个酶活单位。
AH活性(nmol/min/g 鲜重)= C标准品×V标准品×（A测定管－A对照管）÷A标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T
= 2×（A测定管－A对照管）÷A标准管÷W
C标准品：10μmol/L；V标准品：100μL=1×10-4L；稀释倍数： V反总÷V上清液=300μL÷100μL=3；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中粗酶液体积， 50μL=0.05 mL； T：催化反应时间（min），30min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol 4-氨基酚为1个酶活单位。
AH活性(nmol/min/mg prot) = C标准品×V标准品×（A测定管－A对照管）÷A标准管×稀释倍数÷（Cpr×V样）÷T
= 2×（A测定管－A对照管）÷A标准管÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：37℃中每克样本每分钟催化产生1nmol 4-氨基酚为1个酶活单位。
AH活性(nmol/min/g 鲜重) = C标准品×V标准品×（A测定管－A对照管）÷A标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T
= 2×（A测定管－A对照管）÷A标准管÷W
C标准品：10μmol/L；V标准品：100μL=1×10-4L；稀释倍数：V反总÷V上清液=300μL÷100μL=3；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒； W ：样品质量； V样：加入反应体系中粗酶液体积， 50μL=0.05 mL； T：催化反应时间（min），30min。
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文献和实验亦称为氢氧化酶，是加氧酶的一种，是催化利用氧分子形成氢氧化物（酚、醇）反应的酶。所谓单（加）氧酶，除底物外，还需要电子供体（ NADP-H） AH O2 NADPH H → AOH NADP H2 O 在从苯丙氨酸合成酪氨酸，（苯丙氨酸羟化酶），从苯胺合成氨基苯酚（芳基 -4-羟化酶）。从鲨烯（三十碳六烯 squalene）合成类固醇（鲨烯羟化酶）以及进行类固醇的羟基化（各种类固醇羟化酶）等的反应中，都存在着羟化酶。在羟化酶中，多数以 P-450
，分子量 272.4 。主要由卵巢卵泡 Graffian 和胎盘分泌，肾上腺少量分泌。血液中 98%雌二醇 (E2) 主要与性激素结合球蛋白 (SHBG) 结合，以及少量的血清蛋白，如白蛋白。极少一部分成为游离激素。在靶器官，雌二醇受体联合体影响雌激素活性 . 这些器官包括卵泡、子宫、乳房、阴道、尿道、丘脑下部、垂体和肝脏，皮肤也有少量。 应用 本酶联免疫吸附测定试剂盒运用竞争抑制酶标免疫分析法定量测定牛奶中 E2 含量。试剂盒中包含 96 次检测所需的酶联免疫试验试剂，包括标准
在用酶联免疫法测定抗原或抗体时，不论是定量试验还是定性试验都要求使用酶标仪进行测定。一般的酶标仪在测定中均有单波长和双波长的模式，并且采用的都是垂直光路。但在日常工作中有时会不太重视单波长和双波长的选择，对使用单、双波长给测定结果带来的较大差异也不很了解，并且实际工作中也出现了使用单波长检测导致抗HCV部分弱阳性的漏检。因此，本人就酶标仪在选择单、双波长使用方面谈谈个人的体会，供同道参考。 一 材料和方法 1.材料 由上海科华公司提供的乙肝表面抗原测定试剂盒；eppendorf
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