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- DM-CM1033
- 上海
- 2026年01月08日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保质期：
6个月
- 保存条件：
2-8°
- 供应商：
上海笃玛生物科技有限公司
- 库存：
999
- 规格：
96T/48T
几丁质酶（Chitinase）试剂盒说明书
微量法100T/48S
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。
测定原理：
几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与对二甲氨基ben甲醛产生红色化合物，在585nm处有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。
自备实验用品及仪器
天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、甲ben（土壤样品专用）和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体105mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存。（若出现结晶，可80℃左右加热溶解后使用）
试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
2. 真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。
3. 培养液：直接测定。
测定操作表：
|
对照管 |
测定管 |
|
|
粗酶液（µL） |
80 |
80 |
|
提取液（µL） |
120 |
40 |
|
试剂一（µL） |
80 |
|
|
混匀，37℃水浴1h |
||
|
试剂二（µL） |
40 |
40 |
|
混匀，沸水浴7min，5000rpm，4℃，离心10min，取上清200µL。 |
||
|
试剂三（µL） |
40 |
40 |
|
试剂四（µL） |
80 |
80 |
|
混匀，37℃，15min，于微量石英比色皿/96孔板，测定A585，ΔA=A测定-A对照。 |
||
计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.3088-0.003，R2=0.9995
计算公式：
1、 按照样本重量计算
酶活性定义：37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性（mg/h/g鲜重）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
=8.096×（ΔA +0.003）÷W
2、 按照蛋白质浓度计算
酶活定义：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h mg prot）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 8.096×（ΔA +0.003）÷Cpr
3、 按细胞数量计算
酶活定义：37℃条件下，每104个细胞每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /104 cell）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)
=8.096×（ΔA +0.003）÷细胞数量
4、按液体体积计算
酶活定义：37℃条件下，每毫升培养液每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /mL）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷V样=8.096×（ΔA +0.003）
V反总：反应体系总体积，1mL；V样：反应体系中样本体积，0.4mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL
b. 用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.1544x-0.003，R2=0.9995
计算公式：
4、 按照样本重量计算
酶活性定义：37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性（mg/h/g鲜重）=（ΔA+0.003）÷0.1544×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
=16.192×（ΔA +0.003）÷W
5、 按照蛋白质浓度计算
酶活定义：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h mg prot）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 16.192×（ΔA +0.003）÷Cpr
6、 按细胞数量计算
酶活定义：37℃条件下，每104个细胞每小时分解几丁质产生1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /104 cell）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)
=16.192×（ΔA +0.003）÷细胞数量
4、按液体体积计算
酶活定义：37℃条件下，每毫升培养液每小时分解几丁质产生1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性（mg/h /mL）=（ΔA+0.003）÷0.3088×V反总÷V样=16.192×（ΔA +0.003）
V反总：反应体系总体积，1mL；V样：反应体系中样本体积，0.4mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL
注意事项：
1、 反应结束后立即进行比色。
2、 试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。
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文献和实验问：很多生物防治用的真菌可以产生几丁质酶和蛋白酶等代谢产物，现在实验想检测这两种酶的活性的大小，不知道用那种方法，请教各位！有没有简单的方法如平板法，测代谢产物法等，具体方法如何？ 答：可以用透明圈法，具体做法就是提出几丁质粗酶液后在几丁质—PDA培养基上打孔培养一定时间然后观察透明圈的大小，测代谢产物应该是不行，因为几丁质酶分内外切酶，产物不一，测不出来的，你也可以用聚丙烯酰胺电泳检测。具体方法可以参考这篇文章Chitinase system of Bacillus circulans
MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pBS-CHI，无菌ddH2O。 5．实验准备 dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，荧光染料，10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。合成的引物：Sense primer 5＇-GGATCCACAATGATGAGAGCC-３＇ Antisense primer ５＇-GATATCATGGTGAGGTAGCTAGCTT-３＇ 目的基因模板质粒：已经克隆在pBS载体上的1128bp几丁质酶
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