α,β-二氢白藜芦醇，58436-28-5，10mM in

目的基因片段的PCR扩增与克隆

片段。 3.目的片段的克隆 纯化的片段连接到克隆载体pGEM-Tvector，转化导入宿主菌E.coliDH5α，通过蓝白斑筛选，PCR扩增鉴定后测序，获得的含所需要的目的片段的质粒。 （1）pGEM®-TEasy载体系统 I.描述 pGEM®-TEasy载体系统可用于PCR产物的克隆。这种载体是通过EcoRⅤ酶切pGEM®-5Zf(+)和pGEM®-TEasy载体，并在3’末端加入胸腺嘧啶构建的。插入位点3’-T突出端可提高PCR产物的连接效率，因为3’-T突出端可以防止载体的自身环化，并且为

体外DNA重组技术

、质粒的分离和纯化。低浓度的碱和SDS可以有效地裂解细菌的细胞壁，从而使质粒释放出来。 【实验试剂与器材】 1. 细胞悬浮液: 50mM葡萄糖，25mM Tris.Cl,（ pH8.0），10mM EDTA.Na2,（pH8.0） 2. 细菌裂解液: 0.2mol/L NaOH，1% SDS 3. 中和液: 60ml 5M醋酸钾，11.5ml 冰醋酸，28.5ml双蒸水 4. 3mol/L NaAc (pH 5.2) 5. TE饱和酚 (pH8.0) 6. 氯

Raf 蛋白 Ras 结合结构域的简并进化库合成以及利用片段互补法快速筛选二氢叶酸还原酶的快速折叠且稳定的克隆

，分别对应多个独立的 β 转角或环、β 链和一个 α 螺旋（我们构建了两个文库，分别对应该区域的 N 端和 C 端），其长度为 4〜8 个残基 [41，42] 。以此为依据，我们构建了 13 个简并进化库，用 NNK  ( 其中 N 表示任何核苷酸，K 表示 G 或 T ) 取代野生型蛋白的密码子，这就使得 20 种氨基酸中的任何一种都可以插入到每个可变区。然后，在大肠杆菌中利用 DHFR PCA 筛选这些文库中可以与 ras 结合的成员。除了筛选可以完全在体内进行，该方法最大的优点是得到的文库中