CRISPR EDITx™ KO 基因敲除试剂盒-完全版

CRISPR EDITx™ KO 极速敲除试剂盒

【产品名称】CRISPR EDITx™ KO极速敲除试剂盒                                     

【储存条件及有效期】

有效期1年，保存条件-20°C；如长期储存，建议置于-80°C。干冰运输

建议根据使用次数进行分装，避免反复冻融。

 

【产品简介】

CRISPR EDITx™ KO极速敲除试剂盒是一款科研级的即用型CRISPR敲除试剂盒。该产品包含艾迪基因创新研发的CRISPR EDITx™Tran转染试剂以及经数千例实战验证过的Cas酶，为科研工作者提供一种快速高效的基因敲除工具。

CRISPR EDITx™Tran转染试剂是一种基于生物分子辅助递送Cas蛋白和gRNA系统的转染试剂。该转染试剂无细胞毒性，只需与细胞孵育30分钟，即可与Cas-gRNA复合物成功转染至细胞，实现强大的基因编辑能力。

l 高效转染：采用创新研发的CRISPR EDITx™ Tran转染试剂,30min转染，48h检测编辑效率。

l 高效编辑：结合高效转染试剂、经市场验证的Cas酶以及独特gRNA设计逻辑，敲除效率高达95％

l 细胞毒性级低：生物分子辅助Cas-gRNA系统递送转染，进入细胞后迅速释放DNA，并快速降解。

l 普适性强：适用于多数细胞，对于难转染细胞、生长代数受限细胞更有优势。

l 设备要求低：生物分子辅助递送，实现高效编辑，无需电转仪等仪器。

 

注：使用该产品发表文章时，请标注我司名称Guangzhou Editgene Co., Ltd, China，CRISPR EDITx™ KO kit （CAS：EDKO-K03）

 

【产品组分】

产品名称	组分		规格			货号
CRISPR Editx™KO极速敲除试剂盒-完全版	CRISPR EDITx™Tran转染试剂		30uL*5	30uL*10	30uL*25	EDKO-K03
	Cas12a核酸酶（100uM）		20uL	40uL	100uL
	crRNA（1.5nmol， dilute to100μM）		20-30uL	40-60uL	100-150uL
	DNA Lysis	Buffer A	1mL	2mL	5mL
		Buffer B	20μL	40μL	100μL
	PCR Validation	2x High Fidelity Pfu Mix (+Dye)	300μL	600μL	1500μL
		Genotyping Primer F	20μL	40μL	100μL
		Genotyping Primer R	20μL	40μL	100μL

 

【需准备其他实验材料】

1. Opti-MEM I Reduced Serum Medium

2. RNase-free EP管和枪头等

 

【实验步骤】

1. 细胞培养和铺板（以24孔板为例）

请使用适当保存和经常传代的健康细胞，并确保培养基无细菌、真菌或支原体污染。如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞，请在转染前至少传代两次。在进行转染前，可参考表1进行细胞铺板。

注意：本方法不需要抗性筛选，因此无需添加抗生素。

	24-well
细胞数/孔	4~15x104

 

 

2. 细胞转染

2.1配置RNP混合物

转染前24h确认每孔细胞融合度达 40%~60%（如表1推荐的细胞数量），按表2建议，取EP管将 Cas12a酶和 crRNA 混合到Opti-MEM I Reduced Serum Medium培养液中，用枪头混匀，避免产生气泡，称为管1，室温孵育15min。

	24-well	终浓度
crRNA	2.4uL	8 μM
Cas12 nuclease	3uL	10 μM
Opti-MEM™ I Medium	Add to 30μL
孵育30min

 

2.2配置转染复合物

取管1复合物至含30μL CRISPR EDITx™Tran转染试剂的管2，轻轻混匀，室温孵育5min

 

2.3转染目的细胞

PBS清洗细胞2次，吸干上清，加入转染复合物，37℃孵育30 min，更换完全培养基。

 

3. 分析转染细胞

转染48h，提取细胞基因组，进行基因编辑效率分析。

 

3.1pool切割效果检测

① 将 Pool 中 1个复孔的细胞用 PBS 冲洗后，胰酶消化，离心收集细胞，弃上清。

② 按照 1×10⁵~10⁶Cell/mL DNA Lysis 的比例加200 μL DNA Lysis BufferA吹打混匀，加4 μL DNA Lysis BufferB涡旋振荡混匀后，55℃水浴10 min，95℃水浴5 min。

③ 12000 rpm离心5 min，取150 μL上清，上清液即可用于PCR反应。

④ 取 2 μL Pool 的裂解液做模板，按表 1 和表 2 配制 PCR 体系。

 

表1.实验样品配制体系

试剂	体积（每反应）
2x High Fidelity Pfu Mix (+Dye)	25μL
单克隆细胞裂解产物	2μL
Genotyping Primer F	1μL
Genotyping Primer R	1μL
ddH2O	21μL
总体积	50μL

 

⑤ PCR 上机反应，程序如下表：

表 2. PCR 鉴定程序

步骤	温度	时间	循环
预变性	95℃	3min	1 cycle
循环扩增	95℃	15s	35 cycles
	60℃（根据引物Tm值设置）	15s
	72℃	1 min/kb
延伸补偿	72℃	5min	1 cycle

 

⑥ PCR 产物直接点样3μL跑琼脂糖凝胶电泳（不需加 Loading Buffer），若 Pool 裂解产物 PCR 条带为单一条带且与设计理论值条带大小相符，则可直接送PCR 产物进行Sanger测序。

 

3.2单克隆鉴定

与pool切割效果检测步骤一致。

 

应用案例

1.项目信息

细胞名称：THP-1细胞

基因：B2M

 

2.crRNA设计

 

B2M基因编辑位点图示

 

crRNA: UAAUUUCUACUCUUGUAGAUCAUUCUCUGCUGGAUGACGU （骨架20bp、全长40bp）

注：下划线部分为Cas12a的crRNA骨架。

 

3.转染步骤

参考上述实验步骤2

 

4.编辑效率检测

转染48h，收集细胞进行编辑效率检测，ICE Analysis显示编辑效率约为95%。

 

B2M测序结果

 

ICE Analysis结果