柱式骨骼 DNAout

中文名称：柱式骨骼 DNAout
英文名称：Column Bone DNAout
产品及特点：产品介绍： 骨组织坚硬、骨细胞密度低、而且外周基质含有大量黏蛋白（蛋白多糖） 和 DNA 难以分离，改良的 CTAB 法抽提液内（添加多种针对骨特点的多糖去 除成份）迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，氯仿抽提后通过离心清除多糖和 蛋白质，然后基因组 DNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤， 进一步将多糖、细胞代谢物、蛋白 等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组 DNA 从硅基质膜上洗脱。 产品特点：
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极 小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
3. 快速，操作简捷。
4. 得到的 DNA 分子量不均匀，一般在 20 kb 到 100 bp 之间，具体取决 于骨骼的新鲜程度，骨粉的加工方法等。 适用范围： 适用于快速提取骨骼（包括骨粉）样品 DNA。
规格及成分：

成份	大纸盒包装
裂解液 PL	30 mL
结合液 PQ	18 mL 第一次使用前加 36mL 乙醇
抑制物去除液 IR	25 mL
漂洗液 WB	13 mL 第一次使用 前加 52mL 乙醇
洗脱缓冲液 EB	15 mL
吸附柱 AC	50 个
收集管（2ml）	50 个
使用手册	1 份

运输及保存：本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。
储存事项:
1. 裂解液 PL、或者抑制物去除液 IR 低温时可能出现析出和沉淀，可以在 55℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。结合 液 PQ 盐酸胍浓度高，加入乙醇后可能出现一些沉淀不影响使用，直接取上清 用。
2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化，各溶液使用 后应及时盖紧盖子。
使用方法： 标准操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 提示：  第一次使用前请先在漂洗液 WB 和结合液 PQ 中加入指定量的无水乙醇， 充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!  取所需适量裂解液 PL 放置在 65℃预热。
1. 骨粉的制备：用自备酒精将骨骼表面擦洗干净，以防污染物对后续 PCR 的影响，然后用骨钻在处理干净的骨骼区域钻取骨粉。对于已经制备好的、商 品化的骨 粉，可以跳过此步，直接进入下一步。
2. 将 100 mg 骨粉迅速转移到预先装有 600 µl 65℃预热裂解液 PL 的离心 管中，迅速颠倒混匀后，将离心管放在 65℃水浴 1 小时，水浴过程中颠倒离 心管以混合样品数次。 可选步骤：如果预计样品 RNA 丰富易残留，可在水浴前加入 5-6μl RNA 酶 （20mg/ml）。如果组织干燥或者产量低，可以适当延长水浴时间。 注：如果提取的 DNA 残留 RNA 较多导致电泳时候条带拖尾，条带扭曲，背 景很高等不正常电泳情况，可以加 1% RNA 酶（10mg/ml）37℃或者室温 放置半小时即可消化RNA，消化完后不需要特殊处理便可用于PCR或者酶切。
3. 加入 700 µl 氯仿，充分混匀，13,000 rpm 离心 10 min。 可选步骤（一般不需要）：若提取富含多糖样品，可在第 3 步前，用 Tris 饱和酚（PH8.0）/氯仿（1：1）等体积抽提一遍。
4. 小心吸取上清（约 600 µl）到一个新的 1.5ml 离心管（注意不要吸到界 面物质。）加入 1.5 倍体积结合液 PQ （请先检查是否已加入无水乙醇!）后 立刻涡旋，充分混匀。
5. 将混匀的液体转入吸附柱 AC 中，13,000 rpm 离心 30 sec，弃掉废液。 （吸附柱容积为 700 µl 左右，可分次加入离心。）
6. 加入 500μl 抑制物去除液 IR，13,000 rpm 离心 30 sec，弃废液。
7. 加入 600μl 漂洗液 WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000 rpm 离心 30 sec，弃掉废液。
8. 重复操作步骤 7。
9. 将吸附柱 AC 放回空收集管中，13,000rpm 离心 2 分钟。尽量除去漂洗 液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
10. 取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 30-50 μl 洗脱缓冲液 EB，室温放置 3-5 分钟，13,000rpm 离心 1min。将得到的 溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置 2 分钟，13,000rpm 离心 1min。 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果预计和需要产量高，可增大洗脱体积， 如果需要 DNA 浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少 于 30μl，体积过小降低 DNA 洗脱效率，减少 DNA 产量。 如追求最大产量，洗脱缓冲液事先在 80-100℃水浴中预热后再加可以提 高产量。
11. 取少量进行电泳检测。注意：一般 DNA 都呈现弥散状，分布在 20 kb 到 100 bp 这一广泛的范围，其比例跟骨骼（或骨粉）的新鲜程度、加工过程（对 骨粉）等因素密切相关。
 注意事项 1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到 13,000rpm 的传统台 式离心机。 2. 开始实验前将需要的水浴先预热到 65℃备用。 3. 需要自备氯仿、无水乙醇。 4. 结合液 PQ 和抑制物去除液 IR 中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手 套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生 理盐水冲洗。 5. 洗脱液 EB 不含有螯合剂 EDTA， 不影响下游酶切、连接等反应。也可 以使用水洗脱， 但应该确保 pH 大于 7.5， pH 过低影响洗脱效率。用水洗 脱 DNA 应该保存在－20℃。DNA 如果需要长期保存，可以用 TE 缓冲液洗 脱 （10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是 EDTA 可能影响下 游酶切反应，使用时可以适当稀释。