快速内切酶（多指标）

快速内切酶是一系列经过基因工程重组的快速限制性内切酶，适用于质粒 DNA、PCR 产物或基因组 DNA 等的快速酶切。所有快速内切酶在通用的 CutOne  或 CutOne  Color  Buffer 中都具有优良的活性，能够在 5~15min内完成酶切。此外，去磷酸化、连接试剂在 CutOne Buffer 中均具有 100% 活性， 支持一管化反应，提升“酶切 - 修饰 - 连接”的体验。

CutOne  Color Buffer 包括红色和黄色示踪染料，可将产物直接用于凝胶电泳。CutOne  Color Buffer 的红色染料与 2500 bp 双链 DNA 片段在 1% 琼脂糖凝胶中迁移速率接近；黄色染料与 10  bp 双链 DNA 片段在 1% 琼脂糖凝胶中迁移速率接近。

识别位点：
5'...G T ↓ M K A C...3'
3'...C A K M ↑ T G...5'

 

产品组成：

组分	规格
AccI	50μl
10× CutOne Buffer	1ml
10× CutOne Color Buffer	1ml

1、DNA 快速酶切流程

 

（1）在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：

	质粒 DNA	PCR 产物	基因组 DNA
ddH2O	15 μl	16 μl	30 μl
10× CutOne Buffer 或 10× CutOne  Color Buffer	2 μl	3 μla	5 μl
底物 DNA	2 μl (up to 1 μg)	10 μl (~0.2 μg)	10 μl (5 μg)
AccI	1 μl	1 μl	5 μl
Total	20 μl	30 μl	50 μl

a、本体系适用于经过纯化的 PCR产物酶切。未纯化的 PCR 产物具备一定的离子强度，10 × CutOne  Buffer 加入量可适当减少至 2  μl。但由于 DNA 聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行克隆等操作，建议酶切前对 PCR 产物进行纯化。
（2）轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴；
（3）37℃温育 15 min（质粒），或 15~30 min（PCR 产物），或 30~60 min（基因组 DNA）；
（4）80℃温育 20 min 即可使酶失活，停止反应（可选）；
（5）如果使用 CutOne Color Buffer 进行酶切反应，得到的产物可以直接进行上样电泳。

2、双酶切或多酶切
（1）每种快速内切酶的用量为 1 μl，并根据需要适当扩大反应体系；
（2）所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的 1/10；
（3）如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同，应先以最适温度低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，在其最适反应温度下进行酶切反应。

3、适用于质粒的扩大反应体系

DNA	1 μg	2 μg	3 μg	4 μg	5 μg
AccI	1 μl	2 μl	3 μl	4 μl	5 μl
10× CutOne Buffer 或 10× CutOne Color Buffer	2 μl	2 μl	3 μl	4 μl	5 μl
Total	20 μl	20 μl	30 μl	40 μl	50 μl

注：如果总反应体系大于 20 μl，应适当增加温育时间，尽量使用水浴、金属浴或沙浴。

 

不同 DNA 中的酶切位点数量

λDNA	ΦX174	pBR322	pUC57	pUC18/19	SV40	M13mp18/19	Adeno2
9	2	2	1	1	1	1	17

 

甲基化修饰影响

Dam	Dcm	CpG	EcoKI	EcoBI
无影响	无影响	剪切受阻	无影响	无影响

 

在不同反应缓冲液中的活性

	CutOne Buffer	Thermo Scientific FastDigest Buffer	NEB CutSmart®  Buffer	Takara QuickCut™ Buffer
活性	100%	< 10%	100%	< 10%

-20°C 及以下运输及保存，长期保存建议放-80°C 。有效期2年。

建议反应条件:
1 × CutOne 缓冲液；
37℃温育；
参照“DNA 快速酶切流程”配制反应体系。

失活条件：
80℃温育 20 min。

质量控制：
功能活性检测
37℃下，在 20 μl 通用 CutOne  反应体系中，1 μl AccI 能够在 15 min 内完全消化 1 μg λDNA。

超长时间温育检测
37℃下，在 20 μl 通用 CutOne  反应体系中，将 1 μl  AccI 与 1 μg λDNA 共同温育 3 h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解。更长时间酶切可能出现星号活性。

酶切 - 连接 - 再酶切检测
37 ℃下，使用 10 倍酶量的 AccI 消化 DNA 底物，回收酶切产物，在 22 ℃ 下使用 T4 DNA Ligase (Fast) 可以将超过 95% 的酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开 95% 以上的连接产物。

蓝白斑检测
使用 1 μl  AccI 消化含有 lacZα 基因且仅在该基因上具有 1 个酶切位点的特定载体。将酶切产物重新连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，涂布在含有 X-gal、IPTG 和相应抗生素的 LB 平板培养基上生长。成功连接的 β - 半乳糖苷酶基因可以正确表达，并生长出蓝色菌落；而因酶切末端降解等原因未能重新连接的产物将得到白色菌落。对于限制酶而言，白色菌落的比例应当小于 1%。