β-淀粉酶活性检测试剂盒(碘-淀粉比色法) 可见分光光度法

β-淀粉酶（β-AL）活性检测试剂盒（碘-淀粉比色法）说明书

可见分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC4580

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
试剂一	粉剂×1瓶	2-8℃保存
试剂二	液体20mL×1支	2-8℃保存
试剂三	液体40mL×1瓶	2-8℃保存
标准品	粉剂×1瓶	2-8℃保存

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前加入20mL试剂三，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉剂至溶解，用不完的试剂2-8℃保存8周；

2、 标准品：10 mg淀粉标准品。临用前加10 mL试剂三，置沸水浴中振荡溶解，配成1 mg/mL淀粉标准液。2-8℃保存四周。

产品说明：

淀粉酶负责水解淀粉，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2) 从淀粉的非还原端切开α-1,4糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。

碘可以与未被淀粉酶水解的淀粉结合，生成在570nm下有特征吸收峰的复合物，其深浅可计算出淀粉酶的活力单位。α-AL耐热不耐酸，β-AL耐酸不耐热。根据上述特性，钝化其中之一，就可测得另一种活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：称取约0.1g样本，加1mL蒸馏水匀浆；匀浆后在室温下放置提取15min，每隔5min振荡1次，使其充分提取；6000g，常温离心10min，吸取上清液即为淀粉酶原液。

2、液体：直接检测。（若有浑浊则离心后进行测定）

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。

2、 将淀粉标准液用蒸馏水稀释为0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.0015625mg/mL的标准溶液。

 

实验中每个标准管需250µL标准溶液。

3、 按操作表依次加入各试剂：

试剂名称（μL）	α淀粉酶活力测定		总淀粉酶活力测定		空白管5	标准曲线的测定
	测定管1	对照管2	测定管3	对照管4		标准管6	标准空白管7
样本	250	250	-	-	-	-	-
蒸馏水	-	-	-	-	250	-	250
标准溶液	-	-	-	-	-	250	-
70℃水浴15min左右，冷却
样本	-	-	250	250	-	-	-
试剂一	250	-	250	-	250	-	-
蒸馏水	-	250	-	250	-	250	250
于40℃恒温水浴中准确保温5min
试剂二	125	125	125	125	125	125	125
蒸馏水	375	375	375	375	375	375	375

混匀后于1mL玻璃比色皿中测定570nm下的吸光度，从左到右分别记为A1、A2、A3、A4、A5、A6和A7，计算ΔAα=A5-（A1-A2），ΔA总=A5-（A3-A4），ΔA标准=A6-A7。空白管、标准曲线只需做1-2次。

三、β-淀粉酶活性计算

标准曲线的绘制

根据标准管的浓度（x，mg/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。将ΔAα测定带入方程得到x₁（mg/mL），ΔA总代入方程得到x₂（mg/mL）。

2、α淀粉酶活性的计算

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟消耗1mg 淀粉定义为1个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/g 质量)=x₁×V样÷(W×V样÷V样总)÷T=0.2×x₁÷W

（2）按照蛋白质浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。

α-淀粉酶活性(U/mg prot)= x₁×V样÷（V样×Cpr）÷T=0.2×x₁÷Cpr

（3）按液体体积计算：

单位定义：每mL液体每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。

α-淀粉酶活性(U/mL)= x₁×V样÷V样÷T=0.2×x₁

V样：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V样总：样本总体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5min。

3、总淀粉酶活性的计算

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟消耗1mg 淀粉定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性(U/g 质量)=x₂×V样÷(W×V样÷V样总)÷T=0.2×x₂÷W

（2）按照蛋白质浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。

总淀粉酶活性(U/mg prot)= x₂×V样÷（V样×Cpr）÷T=0.2×x₂÷Cpr

（3）按液体体积计算

单位定义：每mL液体每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。

总淀粉酶活性(U/mL)= x₂×V样÷V样÷T=0.2×x₂

V样：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V样总：样本总体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5min。

4、β-淀粉酶活性的计算

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟消耗1mg 淀粉定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(U/g 质量)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=0.2×x₂÷W-0.2×x₁÷W

（2）按照蛋白质浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。

β-淀粉酶活性(U/mg prot)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=0.2×x₂÷Cpr-0.2×x₁÷Cpr

（3）按液体体积计算

单位定义：每mL液体每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。

β-淀粉酶活性(U/mL)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=0.2×x₂-0.2×x₁

注意事项：

吸光值大于1.5或者ΔA大于0.8时，可以对样本进行适当稀释后测定。

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