总胆固醇(TC)含量检测试剂盒 微量法

总胆固醇（Total Cholesterol，TC）是指所有脂蛋白所含胆固醇的总和，包括游离胆固醇（Free Cholesterol，FC）和胆固醇酯（Cholesteryl Ester，CE）。本试剂盒的检测方法是微量法，既可以用可见分光光度计检测，也可以用酶标仪检测。

该产品的最低检出限是0.02 μmol/mL，线性范围为0.03-15 μmol/mL。

_{作用原理是通过酯酶催化胆固醇酯水解生成游离胆固醇（FC）和游离脂肪酸（FFA），从而把胆固醇酯转化为FC；进一步利用胆固醇氧化酶催化FC氧化，生成4-胆甾烯酮和H2O2；最后利用过氧化物酶催化H2O2氧化4-氨基安替比林和酚，生成红色醌类化合物，其在500 nm有特征吸收峰，颜色深浅与TC含量成正比}。作用方式如下：

测定总胆固醇(TC)请选择60723ES 总胆固醇(TC)含量检测试剂盒；测定游离胆固醇(FC)请选择60724ES 游离胆固醇(FC)含量检测试剂盒。

 

组分信息

组分编号	组分名称	规格	储存条件
60723-A	试剂一	60 mL	2~8℃
60723-B	试剂二	400 μL	2~8℃
60723-C	试剂三	60 μL	2~8℃
60723-D	标准品	10 mg	2~8℃

 

使用说明

【注意事项】实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，如果样本吸光值不在测量范围内，建议稀释或者增加样本量进行检测。

1. 需自备的仪器和溶剂：

可见分光光度计/酶标仪、天平、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、可调式移液枪、EP管、蒸馏水和异丙醇。

2. 溶液的配制：

1）自备提取液异丙醇：大约需要110 mL，常温保存；试剂盒内提供一个30 mL棕色空瓶，仅做分装使用。

2）标准品溶液的配置：10 mg胆固醇使用前加入517 μL提取液，振荡溶解后即为50 μmol/mL的胆固醇标准溶液，2~8℃可保存4周。

3）试剂三液体置于试剂瓶内EP管中，用前使用离心机将液体离心至底部。

4）工作液的配制：根据样本量将试剂一、试剂二、试剂三按照6 mL、40 μL、6 μL（共6.046 mL，约12T）的比例配制工作液，现配现用。

3. 操作步骤

1）样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

a. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1 mL提取液）进行冰浴匀浆。10000 g，4℃离心10 min，取上清置冰上待测。

b. ^{细菌/细胞：按照细胞数量（106个）：提取液体积（mL）为 5~10：1的比例（建议500万细菌/细胞加入1 mL提取液），冰浴超声波破碎细菌/细胞（功率300 w，超声2秒，间隔3秒，总时间3 min）；然后10000 g，4℃离心10 min， 取上清置于冰上待测。}

c. 血清（浆）等液体样本：直接测定，若有沉淀请离心后取上清待测。

2）测定步骤

a. 可见分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至500 nm，分光光度计蒸馏水调零。

b. 工作液临用前37℃预热10 min以上。

c. 标准溶液的稀释：将50 μmol/mL胆固醇标准溶液用提取液进行稀释，得到10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μmol/mL的标准溶液备用。

c. 标准溶液稀释可参考下表：

序号	稀释前浓度（μmol/mL）	标准溶液体积（µL）	提取液体积（µL）	稀释后浓度（μmol/mL）
1	50	100	400	10
2	10	200	200	5
3	5	200	200	2.5
4	2.5	200	200	1.25
5	1.25	200	200	0.625
6	0.625	200	200	0.3125

注：实验中每个标准管需10 µL标准溶液（注意不要在此步骤直接检测吸光度）。

d. 在1.5 mL EP管/96孔板按下表步骤加样：

试剂名称（µL）	测定管	标准管	空白管
样本	10	-	-
标准溶液	-	10	-
提取液	-	-	10
工作液	500	500	500
充分混匀，37℃静置30 min，反应完成后吸取200 μL于微量比色皿/96孔板中，测定500 nm处吸光值A，分别记为A测定、A标准和A空白，ΔA测定=A测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白。空白管和标准曲线只需测1-2次。注：若样本为血清（浆）等液体样本，则需要增加‘血清（浆）空白管’-即将空白管中的提取液（异丙醇）更换为蒸馏水进行实验，计算ΔA 测定=A 测定-A 血清（浆）空白，标准管测定及ΔA 标准计算不变。

3) 总胆固醇含量计算

a. 标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（x，μmol/mL）。

b. 总胆固醇含量的计算：

（1）按血清（浆）等液体体积计算：TC含量（μmol/dL）=x×100×F

（2）按样本蛋白浓度计算：TC含量（μmol/mg prot）=x×V提取÷（Cpr×V提取）×F=x÷Cpr×F

（3）按样本质量计算：TC含量（μmol/g 质量）=x×V提取÷W×F=x÷W×F

^{（4）按细胞/细菌数量计算：TC含量(μmol/106 cell)=x×V提取÷N×F=x÷N×F}

100^{：单位换算系数，1 dL=100 mL；V提取：加入样本的提取液体积，1 mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞总数，以106计。Cpr：蛋白浓度，mg/mL；F：样本稀释倍数。}

4. 实验实例：

^{（1）取大鼠血清样本，直接按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=A测定-A空白=0.177-0.044=0.133，根据标准曲线 y=0.066x-0.0069，R2=0.9991，计算 x=2.120，按血清（浆）等液体体积计算含量得：}

TC 含量（μmol/dL）=x×100=212.0 μmol/dL。

^{（2）取0.105 g大鼠肾脏加入1 mL提取液冰浴匀浆，按照测定步骤操作，使用96孔板测得ΔA 测定=A 测定-A 空白=0.124-0.044=0.080，根据标准曲线 y=0.066x-0.0069，R2=0.9991，计算x=1.317，按样本质量计算含量得：}

TC 含量（μmol/g 质量）=x÷W =12.543 μmol/g 质量。

^{（3）取10×106个Hela细胞加入0.5 mL提取液超声破碎，按照测定步骤操作，使用96孔板测得Δ}

A ^{测定=A 测定-A 空白=0.071-0.044=0.027，根据标准曲线 y=0.066x-0.0069，R2=0.9991，计算x=0.514，按细胞数量计算含量得：}

TC ^{含量（μmol/106 cell）= x×V 提取÷N×F =0.026 μmol/10E6 cell}

 

注意事项

1. 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者用提取液稀释样本（血清（浆）用蒸馏水稀释）后再进行测定。但注意同步修改计算公式。

2. 提取液中含有使蛋白变形的成分，故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。

3. 若细胞测定数值较小，可修改样本量和工作液的比例，如改为20+480（稀释倍速为0.5），50+450（稀释倍数为 0.2）或者样本量提至更高体积。

4. 该产品的最低检出限是0.02 μmol/mL，线性范围为0.03-15 μmol/mL。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

6. 本产品仅作科研用途！

 

2~8℃保存，有效期6个月。