冰冻切片

冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。其种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法、二氧化碳冰冻切片法、甲醇循环制冷冰冻切片法等。

冰冻切片详细操作步骤：
1.取材
要进行冰冻切片观察的组织，应尽可能采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化，影响后期染色分析结果。

2.速冻
① 将取好的组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2 cm）。
② 如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。
③ 当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20 s组织即迅速冰结成块。
④ 再制成冻块，使其可置入恒冷箱切片机冰冻切片。
⑤ 若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80 ℃冰箱贮存备用。

3.固定
① 样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10 min让OCT胶浸透组织。
② 取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。
③ 组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30 min。

4.切片
① 恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10 μm。
② 切片时，低温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。
③ 切好后，室温放置30 min后，入4℃丙T固定5-10 min，烘箱干燥20 min。PBS洗5 min×3。
④ 进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5-10 min，消除内源性过氧化物酶的活性。

冰冻切片实验制备的注意事项：
1、新鲜组织的制备
组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，
常用的骤冷剂有：
① CO2气（－78℃）
② 丙T干冰冷却的轻石y醚、乙烷和庚烷（－80℃）
③ 液氮（－190℃）
④ 液氮冷却的丙烷（－19℃）。液氮适用于组织化学，较安全。缺点：组织块易发生龟裂。

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