SYBR Green QPCR预混试剂盒

Genmfast SYBR Green qPCR Mix
产品信息

产品名称	产品编号	规格
Genmfast SYBR Green qPCR Mix (No ROX)	RL10222	1 mL
	RL10223	5 mL
	RL10224	25 mL
50×High Rox	RN10273	200 μL
50×Low Rox	RN10274	200 μL

产品描述
Genmfast SYBR Green qPCR Mix是采用SYBR® Green I 嵌合荧光法进行qPCR反应的专用试剂。本产品通过对 SYBR®/FAM 通道进行荧光信号定量检测，可以获得 PCR 过程中 DNA 扩增的真实数据。本产品采用抗体法热启动 Taq DNA 聚合酶进行扩增，在保证扩增效果的同时极大地提高了产品的特异性。
本产品为 2X 浓度的预混液（含有High Rox/Low Rox），除引物和模板外包含了所有qPCR所需成分，为实验操作提供了极大便利。
保存条件
-20℃避光保存
适用机型
High Rox适用机型：ABI5700,7000,7300,7700,7900HT Fast,StepOne,StepOne Plus;
Low Rox 适用机型：ABI7500,7500 Fast,ViiA7,QuantStudio3 and 5, QuantStudio6,7,12kFlex; StratageneMX3000P,MX3005P,MX4000P;  
不需要Rox校正的仪器型号：
Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;
Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2s; Qiagen Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science LightCycler480, LightCycler2.0; Lightcycler96;Thermo Scientific PikoReal Cycler;
Cepheid SmartCycler; Illumina EcoqPCR. 
注意事项
1. Genmfast SYBR Green qPCR Mix在使用前请充分融解，避免强光直射，并避光保存。
2. 产品中含有甘油，在使用前请轻轻混匀，避免产生气泡；取用前应混匀并离心。使用后立即放回-20℃冰箱保存。
3. 本品含有聚合酶，使用时请置于冰上，短时间内多次使用可在4℃暂存，应尽量避免反复冻融。
操作说明
实验准备：
1. 相应 EP 管、PCR 管、移液器和枪头、冰盒或冰。
2. qPCR引物和相应模板。
3. qPCR专用平板及密封光学薄膜。
操作方法：
1. 配制反应体系：
推荐冰上配制反应体系：

组分	加入体积	加入体积
Genmfast SYBR Green qPCR Mix	10 μL	25 μL
正向引物(10 μM) *	0.4 μL	1 μL
反向引物(10 μM)	0.4 μL	1 μL
50×High or Low Rox	0.4 μL	1 μL
模板 DNA	X	X
ddH2O	to 20 μL	to 50 μL

【注】: a、以10-100ng 基因组 DNA，或 1-10ng cDNA 为模板参照量，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。另外，两步法 RT-qPCR 反应的cDNA（RT反应液）作为模板时，添加量不要超过qPCR反应液总体积的10%。
b、参比染料：Rox的添加，可根据不同仪器型号进行选择，具体可参考【适用机型】
c、注：通常引物终浓度为0.2 µM 时可以得到较好的结果，可以终浓度0.1-1.0µM 作为设定范围的参考。

1. 反应程序：

1）两步法扩增程序*

步骤	温度	时间	循环数
预变性**	95℃	3 min	1
循环反应	95℃	10 sec	40
	60℃***	30 sec****
熔解曲线	仪器默认设置		1

1. 三步法扩增程序

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	3 min	1
循环反应	95℃	10 sec	40
	55-60℃***	20 sec
	72℃	20 sec****
熔解曲线	仪器默认设置		1

*高特异性扩增可以选择两步法，高效率扩增可以选择三步法。
**预变性时间可以根据不同模版和引物的具体情况适当缩短至2 min。
***退货时间可以根据引物和目的基因的长度调整。
****为确保延伸后进行信号采集，延伸时间根据qPCR仪所需数据采集时间自行调整：
30sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science；LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96
31sec以上：Applied Biosystems:7300
34sec以上：Applied Biosystems:7500
数据分析
1. 根据Ct值和样品投入量绘制标准曲线。标准曲线相关系数(R²)＞0.98，标准曲线斜率介于-3至-3.5之间，PCR扩增效率(E)一般介于90-120%之间。
2. 重复管之间Ct值的 STD＜0.2，不同批次间同一实验的Ct值的STD＜0.5（不同批次同一实验对比需保证阈值设置基本一致）。
3. 扩增产物的熔解曲线无明显非特异性扩增产物(杂峰)或引物二聚体杂峰(必要时请进行琼脂糖电泳确认)，并且熔解曲线的Tm值一般在80-95℃之间。
4. 有效Ct的确认：有效的扩增的Ct值应小于无模板对照曲线的Ct值，并且其熔解曲线无杂峰。