ssDNA/RNA环化连接酶

描述： ssDNA/RNA CircLigase 为热稳定的 DNA/RNA 连接 酶，不依赖于 ATP，可催化单链 DNA 或单链 RNA 的分子内 环化。环化反应中，要求催化底物单链 DNA/RNA 具有 5’- 磷酸基团和 3’-OH 基团。对于大于 15nt 的单链底物，该酶 都能高效的连接。 

货号	产品名称	规格
XG-P3035	ssDNA/RNA环化连接酶	2000U
XG-P3035	ssDNA/RNA环化连接酶	20KU

组分

活性定义：65°C 1h 条件下，催化 1pmol 5’-磷酸化的 ssDNA
底物环化，所需的酶量定义为 1Unit。
储存：-20℃可保存 3 年。
反应实例
1. 按以下组分配制反应液
CircLigase (100 U/μl) 1 μl
5’磷酸化 ssDNA/RNA 10-100 pmol
10×CircLigase Buffer 2 μl
50mM MnCl2 1 μl
ddH2O Up to 20 ul
65°C 孵育 1h 进行环化反应。
2. 失活反应
反应结束后，可加入终浓度 10mM EDTA 终止反应。或采用
加热方式 85℃ 10min 加热失活。
使用注意事项：
(1) 环化底物 ssDNA 或 RNA 必须带有 5’磷酸基团，3’端含有 OH。
(2) 环化体系中的 ATP 浓度高于 20μM 以上时会极大抑制环化效率，甚至导致环化失败。因此建议底物为纯化产物。
(3) 由于本酶提高了耐热性，在 65℃条件下进行连接反应，测试中 Betain 无益于连接效率提升。
(4) 本酶主要进行分子内环化连接，分子间的连接未检测到。
(5) 本酶对 ssDNA 和 RNA 的环化效率极高，多数情况下，90%以上的底物被环化。未被环化的 ssDNA 可通过加入 5U的 Exonuclease I，37°C 消化 15min 去除，以获得高纯度的环化 ssDNA。未环化的 ssRNA，将稍后给出去除方案。
(6) 本酶可以连接 15nt 以上的核苷酸，更长的产物连接参数， 将稍后给出测试报告及 protocol。
(7) 对于连接底物量较少的实验来讲，推荐缩小体系，而不是减少酶的用量。在小体系实验时注意体系的蒸发，可加入矿物油以防止蒸发。

  PCR反应条件优化：
1、变性温度和时间：
ssDNA/RNA环化连接酶保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。
 

PCR的特点：
特异性强：使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。
灵敏度高：进行两轮PCR扩增，可以执行更多的循环，从低拷贝样本中扩增得到足量的产物，克服了单次扩增平台期限制，提高PCR的灵敏度。

 
降落PCR与温度梯度PCR的区别：
降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。
温度梯度PCR是为了找到最适的退火温度，设置不同的退火温度进行多管PCR，将其分别放置在PCR仪中的不同温度模块进行反应，最终找到最适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。
降落PCR是为了提高反应的特异性，通过设计一系列不断降低的退火温度，在同一PCR管内进行PCR扩增，最终获得大量的特异性扩增产物。
与温度梯度PCR相比，降落PCR更有优势。温度梯度PCR需要多次反应或多管反应找到最适的退火温度，之后还需以找到的最适退火温度再次进行PCR，才能得到较好的扩增效果，操作比较繁琐。降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最适退火温度的优化和测定工作。
降落PCR适用于不确定引物的最适Tm值，或引物扩增效果不佳时，不了解目的模板同源性程度，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要，降落PCR还可与其它PCR方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。
公司正在出售的产品：

人副流感病毒3型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒	天青杀素/肝素结合蛋白ELISA试剂盒 AZU/HBP免费代测试剂
葡萄球菌属通用探针法荧光定量PCR试剂盒	DNA甲基转移酶3AELISA试剂盒 DNMT3A免费代测试剂
肠贾第虫PCR检测试剂盒	抗绒毛膜促性腺激素抗体ELISA试剂盒
枪状肝吸虫PCR检测试剂盒	EB病毒衣壳抗原ELISA试剂盒
传染性肌肉坏死病病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒	G蛋白偶联受体152ELISA试剂盒
芽囊原虫通用染料法荧光定量PCR试剂盒	ICOS配体ELISA试剂盒
阴沟肠杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒	K-乙酰转移酶5ELISA试剂盒
出血性大肠杆菌O157:H7(EHEC O157)核酸检测试剂盒	Megane蛋白ELISA试剂盒
传染性胃肠炎病毒PCR检测试剂盒	Nei内切核酸酶Ⅷ样蛋白1ELISA试剂盒
异源曼氏杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒	N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶1ELISA试剂盒
肠出血性大肠杆菌PCR检测试剂盒说明书	人异质性胞核核糖核蛋白L(HNRPL)抗体试剂盒ELISA
耶氏肺孢子虫染料法荧光定量PCR试剂盒	人基质金属蛋白酶抑制因子4(TIMP-4)ELISA试剂盒
苹果锈果类病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒	ssDNA/RNA环化连接酶人信号传导子及转录激活子6(STAT6)检测试剂盒elisa
牛鼻炎病毒型PCR检测试剂盒	大鼠抗核膜糖蛋白210抗体(gp210)ELISA Kit
汉坦病毒型PCR检测试剂盒	大鼠乙酰胆碱(Ach)ELISA Kit