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- Gemini
- XJC5113
- 国产/进口
- 2025年07月12日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
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100
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信帆生物
(20 管/10 样)
一、主要用途
线粒体呼吸链复合物 I（NADH－辅酶 Q 还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶 Q 同功类似物和特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品（动物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样品的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）－辅酶 Q 还原酶的特异性活性检测。其用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。
二、技术背景
线粒体呼吸链复合物I，通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶Q还原酶（reduced nicotinamide adeninedinucleotide coenzyme Q reductase；NADH-CoQ reductase），又称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase），是线粒体电子传递链中最大的结构成分：含有30至40多个多肽结构。其特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的NADH－辅酶Q还原酶（NADH:Q Reductase）。复合物I催化线粒体内电子由供体NADH传递到内膜上辅酶Q受体（泛醌；ubiquinone）的能量转移反应，为整个呼吸链反应系统的第一步。基于辅酶Q底物，在鱼藤酮存在与否的情况下，通过NADH－辅酶Q还原酶的催化，转化成还原型泛醌（CoQH2），同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），在分光光度仪下产生吸收峰值的变化（340nm 波长），由此定量测定NADH－辅酶Q还原酶的特异活性。其反应系统是：
三、产品内容
缓冲液（Reagent A） 20 毫升
反应液（Reagent B） 2.5 毫升
阴性液（Reagent C） 2 毫升
底物液（Reagent D） 500 微升
专性液（Reagent E） 200 微升
产品说明书 1 份
四、保存方式
－20℃冰箱保存，避免反复冻融；反应液（Reagent B）含有毒性物质，避免直接用手接触；反应液（Reagent B）和底物液（Reagent D），避免光照，有效保证 6 月
五、用户自备
比色皿：用于比色分析的容器
双波长分光光度仪：用于比色分析
培养箱：用于孵育反应物
六、实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；缓冲液（Reagent A）室温预热；反应液（Reagent B）和底物液（Reagent D）注意避光。然后进行下列操作。
（一）、测定准备
1、准备好待测样品（例如纯化线粒体样品等），置于冰槽里
2、设定好双波长分光光度仪（温度为 30℃）：波长分别为 340nm 和 380nm，间隔 30 秒，读数 7 次（共 3 分钟），并置零
（二）、背景对照测定
1、移取 780 微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入 100 微升反应液（Reagent B）
3、加入 20 微升底物液（Reagent D）
4、放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
5、加入 100 微升阴性液（Reagent C）
6、上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
7、即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：
（340 波长读数－380 波长读数）0 分钟－（340 波长读数－380 波长读数）1 分钟或 3 分钟
（三）、样品总活性测定
1、移取 780 微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入 100 微升反应液（Reagent B）
3、加入 20 微升底物液（Reagent D）
4、放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
5、加入 100 微升待测样品（注意：10 微克总线粒体蛋白）
6、上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
7、即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：
（340 波长读数－380 波长读数）0 分钟－（340 波长读数－380 波长读数）1 分钟或 3 分钟
（四）、样品非特异活性测定
1、移取 760 微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入 100 微升反应液（Reagent B）
3、加入 20 微升专性液（Reagent E）
4、加入 20 微升底物液（Reagent D）
5、放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
6、加入 100 微升待测样品（注意：10 微克总线粒体蛋白）
7、上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
8、即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：
（340 波长读数－380 波长读数）0 分钟－（340 波长读数－380 波长读数）1 分钟或 3 分钟
七、注意事项
1、本产品为 21 次（10 个样本）操作，包括背景对照测定
2、操作时，须戴手套
3、系统操作过程中，背景测定只需 1 次
4、线粒体样品检测前，须溶解；建议冻存融解（－70℃至 37℃）循环 3 次
5、如果增强酶活检测，建议使用线粒体复合物待测样品预处理试剂盒
6、加入样品启动反应后 3 秒内即刻比色测定
7、如果样本存在明显干扰，可以选择进行样本背景对照测定，即不加反应液（Reagent B），加入待测样品替代阴性液（Reagent C）
8、 通常反应 1 分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续 3 分钟
9、 测定值由高到低变化，即 3 分钟测定读数低于 0 分钟测定读数，表明有酶活性
10、比色测定后，比色皿须清洗彻底
11、通常比色测定的 OD340 起始读数 0.5 为理想状态
12、如果用户没有双波长同步测定分光光度仪，可以使用单波长 340nm 替代，注意活性计算时，毫摩尔吸光系数变成 6.2
13、建议待测样本线粒体蛋白浓度为 10 微克/100 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供线粒体溶解试剂盒为后续的线粒体蛋白浓度测定的预处理试剂盒和Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒）
14、如果使用细胞或组织裂解悬液，则蛋白浓度为 50 微克/100 微升
15、样品特异活性是指鱼藤酮敏感的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸－辅酶 Q 还原酶，去除其它干扰因素（例如复合物 II/III/IV 等）
16、如果用户需要研究线粒体呼吸链复合物 I 总活性包括鱼藤酮敏感和抗性之和，请咨询技术顾问，另购补充反应液（Reagent B+）
17、线粒体呼吸链复合物 I（NADH－辅酶 Q 还原酶）单位活性定义为：在 30℃，pH 7.5 条件下，每分钟内能够氧化 1 微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
18、本公司提供系列线粒体及其酶类技术产品
八、质量标准
本产品经鉴定性能稳定;本产品经鉴定检测准确。
线粒体呼吸链复合物 I 活性比色法定量检测试剂盒
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文献和实验做了 5 年的 MTT 实验 ，耗费了上万块 96 孔板。有成功的喜悦，有失败的沮丧，有好多话要对各位实验同仁说。在这之前，我们先回顾一下 MTT 的原理及操作步骤。实验原理MTT 是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下，生成蓝色的 formazan 结晶。formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原，无法形成结晶），且该结晶溶解于 DMSO。利用酶标仪测定波长 490 nm 处的光密
琥珀酸脱氢酶硝基蓝四唑盐法 在生物代谢过程中，由氢的供体(donor)把氢原子转移到氢的受体(receptor)的酶促反应称脱氢酶反应，该反应由脱氢酶(dehydrogenases)催化。脱氢酶种类很多，其活性均可通过四唑盐显示。四唑盐作为脱氢酶反应中的受氢体，接受脱氢酶作用于底物所释放的氢而形成有色的甲腊(formazane)，沉积于酶所在部位。 琥珀酸脱氢酶(succlnate dehydrogenase，SDH)是线粒体呼吸链的第一个酶，存在于所有有氧呼吸的细胞
酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分钟所分解的底物量（或生成的产物量）μmol数表示之。测定酶活性的方法很多，常因反应的底物和产物的性质不同可选用不同的方法，应用最广泛的是比色法或分光光度法。凡反应系统中的化合物在紫外区或可见光区有吸收峰的都可以用这种方法进行测定。如果酶催化的是一需氧反应，如氧化酶，则可用测压法或氧电极法。如果催化的反应系统中需要ATP或产生ATP，如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脱氢酶和氧化还原酶；或者反应产生H2O2，如一些氧化酶，这些酶的活性可以用生物发光或化学发光方法进行
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