Human分离PBMC细胞(冻存服务)19121878899

1.PBMCs主要包括两类细胞:淋巴细胞和单核细胞。

(1). 淋巴细胞（Lymphocytes）

占PBMCs的70%-90%，是适应性免疫和固有免疫的核心成分，分为以下亚群:

T细胞:

• • 起源:淋巴系祖细胞在骨髓中形成前体T细胞(Pro-T cells)，迁移至胸腺(Thymus)中成熟。
• • 外周血分布:成熟后进入血液，参与循环和免疫监视。

B细胞:

• • 起源:在骨髓中直接分化成熟(B细胞发育的全过程均在骨髓中完成)。
• • 外周血分布:成熟B细胞进入血液，可迁移至淋巴结或脾脏。

NK细胞：

• • 起源:部分由淋巴系祖细胞在骨髓中分化，也可能在肝脏或脾脏中发育。
• • 外周血分布:直接释放到血液中，发挥固有免疫功能。

(2). 单核细胞(Monocytes)

占PBMCs的10%-30%，是固有免疫的重要组分:

• • 起源:由髓系祖细胞在骨髓中分化生成，经历单核母细胞(Monoblast)、前单核细胞(Promonocyte)阶段后成熟。
• • 外周血分布:成熟单核细胞从骨髓释放入血，短暂循环(1-3天)后迁移至组织，分化为巨噬细胞或树突状细胞。

组分	PBMCs中各细胞占比
单核细胞	10-30%
淋巴细胞	70-90%
T淋巴细胞(CD3+)	45-70%
CD4+T淋巴细胞	CD3+T淋巴细胞的25-60%
CD8+T淋巴细胞	CD3+T淋巴细胞的5-30%
B淋巴细胞	5-15%
自然杀伤细胞	5-10%
树突状细胞	1-2%
干细胞	0.1-0.2%

2.PBMCs的外周血来源

PBMCs并非长期驻留在血液中，而是动态循环的免疫细胞：

骨髓起源与持续输出:

• •所有PBMCs均由骨髓造血干细胞分化产生，健康成人每日向血液释放约1-2×10⁹个淋巴细胞和5×10⁸个单核细胞。
• •特定亚群(如效应T细胞、浆细胞样树突细胞)可在胸腺或脾脏等器官终末分化后进入循环。

迁移与归巢：

• • 淋巴细胞循环:通过表面归巢受体（如L-选择素、CCR7）介导，在血液-淋巴系统间循环，定期进入淋巴结、脾脏等次级淋巴器官执行免疫监视。
• • 单核细胞分化:受CX3CR1/CCR2等趋化因子驱动，迁移至外周组织分化为巨噬细胞（如肝库普弗细胞）或树突状细胞，部分亚群可重新进入循环。

稳态与应激调控网络:

• • 基础维持：IL-7/IL-15促进淋巴细胞稳态增殖，M-CSF调控单核细胞池稳定性。
• • 应急响应：感染/炎症触发GM-CSF、G-CSF等因子级联反应，促使骨髓造血干细胞加速分化和释放，6-12小时内外周血单核细胞数量即可翻倍。
• • 动态平衡：短寿命效应细胞（如炎性单核细胞）与长寿命记忆淋巴细胞（如中枢记忆T细胞）共存，通过凋亡/存活信号（如BCL-2家族）维持群体稳定性。

3. 排除的细胞类型

以下细胞因“多叶核”或无核，不属于PBMCs：

(1)粒细胞是一类具有分叶核(多形核)和胞质颗粒的白细胞，包括：

• • 中性粒细胞：占外周血白细胞的50%~70%，是急性炎症反应的主力。
• • 嗜酸性粒细胞：参与抗寄生虫免疫和过敏反应。
• • 嗜碱性粒细胞：释放组胺等介质，参与过敏和抗寄生虫反应。

排除原因

• • 密度差异：粒细胞密度较高（>1.077 g/mL），在密度梯度离心（如Ficoll法）中会沉降到离心管下层（与红细胞一起），而PBMCs（密度较低）位于中间的白膜层。因此，通过标准密度梯度离心法分离PBMCs时，粒细胞会被物理性排除。
• • 细胞核形态：粒细胞核呈分叶状（多形核），不符合“单个圆形/卵圆形核”的定义。

(2)红细胞

特征

• • 无细胞核：成熟红细胞缺乏细胞核和线粒体，主要负责运输氧气。
• • 高密度：红细胞密度极高（约1.10 g/mL），离心后沉降至管底。

排除原因

• • 物理去除：
• • 在密度梯度离心中，红细胞因密度大直接沉底。
• • 若样本中残留红细胞，可通过 红细胞裂解液（如ACK缓冲液） 选择性裂解去除。

(3)血小板（无核细胞碎片）。

特征

• • 无核细胞碎片：由骨髓巨核细胞脱落形成，参与凝血和伤口修复。
• • 体积小：直径仅2-4µm，远小于PBMCs（淋巴细胞约7-15µm，单核细胞约12-20µm）。

排除原因

• • 离心分离：
• • 低速离心时，血小板因体积小、密度低，通常悬浮于血浆层中。
• • 在PBMCs分离过程中，可通过多次离心洗涤去除残留血小板。

三、PBMC分离实验操作

(一)原理解析

密度梯度离心法

• • 密度梯度介质：常用 Ficoll-Paque™ 或 Percoll 溶液（密度约1.077 g/mL），其密度介于血浆（约1.025 g/mL）和红细胞/粒细胞（>1.08 g/mL）之间。

细胞类型	密度范围 (g/mL)	密度原因
红细胞	1.10~1.12	- 无细胞核，胞内充满血红蛋白（高浓度蛋白）。- 细胞膜柔韧但致密。
粒细胞
- 中性粒细胞	1.080~1.090	- 胞质含大量溶酶体颗粒。- 分叶核结构紧密，细胞质比例低。
- 嗜酸性粒细胞	1.090~1.095	- 胞质含大量嗜酸性颗粒（含碱性蛋白），密度高于中性粒细胞。
- 嗜碱性粒细胞	1.085~1.090	- 胞质含嗜碱性颗粒（含肝素、组胺），颗粒密度略低于嗜酸性粒细胞。
淋巴细胞	1.050~1.077	- 核大胞质少，核质比高。- 无颗粒或仅有少量溶酶体。
单核细胞	1.060~1.070	- 体积大但胞质多（含水率高）。- 含少量溶酶体，无致密颗粒。
血小板	<1.030	- 无细胞核，体积微小（2~4 μm）。- 细胞碎片状，密度极低。
有核红细胞（网织红细胞）	1.077~1.090	- 未成熟红细胞，残留少量细胞器和RNA。- 密度介于成熟红细胞和淋巴细胞之间。

密度差异的核心原因：

• • 细胞核形态：单核细胞（单个核）密度低，粒细胞（分叶核）密度高。
• • 胞质成分：颗粒（如中性粒细胞的溶酶体、嗜酸性粒细胞的碱性蛋白）显著增加密度。
• • 体积与含水率：单核细胞体积大但含水多，密度较低；红细胞因无核且血红蛋白致密，密度最高。

离心分层：

• • 全血经稀释后（通常用PBS或生理盐水）缓慢铺在密度梯度液上层。
• • 离心时（如400 ×g，30分钟，室温无刹车），不同密度的细胞按以下顺序分层：
• • 上层：血浆、血小板（密度最低，<1.025 g/mL）。
• • 中间白膜层（PBMCs层）：淋巴细胞和单核细胞（密度≈1.077 g/mL）。
• • 下层：粒细胞和红细胞（密度>1.077 g/mL）。
• • 最底层：离心管底部的红细胞和粒细胞沉淀。

(二)实验操作

抗凝全血 → 稀释血液 → Ficoll梯度离心 → 收集白膜层 → 洗涤 → 红细胞裂解（可选） → 计数 → 保存/后续实验

1.实验准备

试剂与耗材

类别	具体物品
试剂	- 抗凝全血（EDTA/肝素抗凝）- Ficoll-Paque™ PLUS（密度1.077 g/mL）- PBS缓冲液（含2% FBS或BSA）- 红细胞裂解液（如ACK缓冲液，可选）
耗材	- 15 mL或50 mL无菌离心管- 无菌移液管（5 mL、10 mL）- 无菌吸头（1 mL、5 mL）- 细胞筛（70 μm，可选）
仪器	- 低速离心机（水平转子，可调温度）- 生物安全柜（无菌操作台）- 倒置显微镜（细胞计数）

2.实验操作步骤

(1)样本预处理

①稀释血液：

• • 将抗凝全血与等体积的PBS（或生理盐水）轻轻混匀（如10 mL全血 + 10 mL PBS）。
• • 目的：降低血液粘稠度，促进分层。

②准备离心管：

• • 在15 mL或50 mL离心管中预先加入Ficoll分离液（体积比为全血的1/2~1/3，如10 mL稀释血需加5 mL Ficoll）。
• • 注意管壁上尽量不要残留Ficoll液滴会影响分离效果

(2)梯度离心

①铺层：

• • 将稀释后的血液沿管壁缓慢加至Ficoll液上层，避免滴加速度过快扰动分离液与血液分层界面。
• • 技巧：倾斜离心管，用移液管缓慢滴加，待血液层有一定厚度之后回正离心管。

②离心条件：

• • 设置离心机：400 ×g，室温，20~30分钟（调节离心机使得启动速度和停止速度降到最低）。
• • 如果离心机启动速度和停止速度过快，液体可能因突然的离心力变化发生晃动或混合，导致实验失败

③离心后分层（自上而下）：

• • 上层：血浆/PBS混合层（含血小板）。
• • 中间白膜层：PBMCs（淋巴细胞+单核细胞）。
• • 下层：Ficoll分离液。
• • 底层：粒细胞和红细胞沉淀。

(3)收集PBMCs

①吸取白膜层：

• • 用无菌移液管小心吸取白膜层（约1~2 mL），转移至新离心管中。
• • 关键：避免吸入下层Ficoll液或上层血浆。

②洗涤细胞：

• • 加入10 mL PBS（含2% FBS），混匀后离心：300 ×g，5分钟，室温。
• • 弃上清，重复洗涤1~2次，去除残留血小板和Ficoll液。

③红细胞裂解（可选）：

• • 若吸取白膜层并洗涤一次后，细胞沉淀中有红细胞残留，加入2-3 mL ACK红细胞裂解液，室温孵育3分钟，然后PBS洗涤1~2次。

(4)细胞计数与保存

①重悬细胞：

• • 用适量培养基（如RPMI 1640）或PBS重悬细胞，过70 μm细胞筛（去除细胞团块）。

②细胞计数：

• • 取10 μL细胞悬液，台盼蓝染色后显微镜下计数，计算活细胞浓度。

③保存：

• • 立即用于后续实验，或冻存于液氮（需含10% DMSO的冻存液）。

(三)、注意事项

1.血液样本处理注意事项

血液新鲜度

• • 要求：使用新鲜采集的抗凝血（采集后 24小时内 处理，理想情况下 4-6小时内 完成分离）。
• • 原因：血液放置过久会导致细胞活性下降（尤其淋巴细胞易凋亡）。红细胞可能溶血，释放血红蛋白污染PBMC。
• • 保存方法：若需短时间保存，将血液置于 室温（18-25℃），避免冷藏（低温促进红细胞聚集）。

抗凝剂选择

• • 推荐：肝素（Heparin）或EDTA抗凝管，避免使用枸橼酸钠（可能抑制后续细胞功能实验）。
• • 注意：肝素可能干扰PCR实验，需根据下游应用选择抗凝剂。

2.温度控制

操作温度

• • 离心和分层步骤：全程在 室温（18-25℃） 进行，避免低温导致Ficoll密度变化或红细胞聚集。
• • 细胞洗涤与保存：洗涤细胞时使用预冷的PBS（4℃），减少细胞代谢。最终PBMC重悬于4℃保存液（如含血清的培养基）或立即用于实验。

离心机温度

• • 常规PBMC分离无需开启离心机制冷功能，但需确保离心机处于室温环境。

3.离心参数优化

缓慢升速（Soft Acceleration）

• • 设置：离心机启动时选择最低加速档（如“Soft Start”模式）。
• • 原因：快速升速会导致液体惯性晃动，破坏血液与Ficoll的界面分层。梯度离心依赖稳定的密度分层，突然加速可能混合不同密度液体。

缓慢降速（关闭刹车）

• • 设置：离心结束后关闭刹车功能，让转子自然停止（约3-5分钟）。
• • 原因：刹车骤停产生的惯性力会扰动分层界面，导致PBMC层与红细胞/粒细胞混合。自然降速可维持白膜层的完整性，提高回收率。

离心力与时间

• • 标准参数：400-500×g，离心 20-30分钟（具体参考Ficoll说明书）。
• • 离心力过高可能导致粒细胞污染，过低则PBMC回收率下降。

转子类型

• • 推荐使用 水平转子（Swinging Bucket Rotor），而非固定角转子，以确保离心时形成清晰的水平分层界面。

4.白膜层吸取技巧

定位白膜层

• • 离心后分层（从上到下）：血浆层（透明/淡黄色）→ 白膜层（灰白色云雾状，含PBMC）→ Ficoll层（透明）→ 红细胞/粒细胞层（红色）。

吸取步骤

• • 工具：使用无菌移液管或1mL移液枪（调至低速吸取模式）。
• • 方法：避免触及下层Ficoll或红细胞层（防止污染）。若白膜层松散，可连带少量血浆或Ficoll层，后续通过洗涤去除杂质。

常见问题

• • 白膜层不明显：可能因血液过量、离心力不当或分层混合导致，需优化离心参数。
• • 红细胞污染：可通过红细胞裂解液（如ACK Buffer）处理，但可能影响细胞活性。

5.细胞洗涤与保存

细胞洗涤

• • 洗涤缓冲液：使用含2%胎牛血清（FBS）的PBS或生理盐水，减少细胞结团。
• • 洗涤离心参数：250-300×g，离心 5-10分钟，避免高速离心导致细胞损伤。

细胞保存

• • 短期（<24小时）：4℃保存于含10% FBS的培养基。
• • 长期：冻存于液氮（需添加冷冻保护剂如DMSO）。

6.其他关键注意事项

避免微生物污染

• • 全程无菌操作（超净台、无菌试剂和耗材）。
• • 若血液来自传染病患者，需按生物安全等级处理（如BSL-2实验室）。
  离心管平衡
• • 对称放置的离心管重量差需 <0.1g，避免离心机振动破坏分层。

细胞计数与活性检测

• • 使用台盼蓝染色或自动细胞计数仪评估PBMC活率（理想活率 >95%）。
• • 记录实验参数
• • 记录血液采集时间、离心力、离心时间、细胞得率等，便于优化重复实验。

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清华大学《Nature Metabolism》

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YaYuBio冻存PBMC常规可提供包装:100 Million/支、25 Million/支、50 Million/支、10 Million/支，等等