CV21-Zero Background pTOPO-TA/Blunt Cloning Kit ( 零背景pTOPO-TA/Blunt 通用克隆试剂盒)
► 本 TOPO 载体连接体系按照 10 μl 一次计算可以用 20 次，如果按照其它公司产品 5 μl 一次计算，使用次数可以增加一倍，20 次可用 40 次。
▲ -20℃储存，至少 12 个月。冰袋运输，1-2 天置于室外常温不影响质量。
本制品和传统的 T4 连接酶原理不同，它利用了 Topoisomerase 可以在瞬间（几秒钟 - 几分钟）、高效（接近 100%）连接 DNA 片段的原理采用本公司独创的工艺制成。
- 可以在瞬间（几秒钟 - 几分钟）完成任意 PCR 产物（兼容 A 末端 / 平末端）连接。
- 特制的新型载体质粒大小仅仅不到 2kb，充分发挥了 TOPO 载体越小，可容纳片段越大的优势，最大限度提高了大片段连接效率；连接后质粒大小比传统超过 2kb 以上，质粒越小，转化效率越高，极大的提高了各种片段连接后的转化子数量。
- 采用氨苄抗性载体只需 0-10 分钟复苏时间，比卡那抗性载体 1 小时复苏时间缩短 6 倍。
- 最终可以省略 1 小时复苏步骤，热休克冰浴后，不用加 LB 复苏，直接将感受态涂板即可。从连接到涂板全程只需 15 分钟。
- 自杀基因零背景原理，无自连假阳性，无需蓝斑白班筛选和菌落 PCR 筛选。大片段情况下随机挑一个克隆便是有插入的（接近 100%）。
- 连接部分能力远超传统 TA 克隆体系，可连接长达 10 kb 片段（例如连接 5 kb 片段，也可能达到挑 10 个菌落，至少 8 个是有插入的效果），是新一代世界领先的简单、快速、零背景免筛选的 TOPO TA 克隆载体。
测序只能采用 M13F/M13R 通用引物测序（见后面图谱），但是不能采用 M13 (-47)/M13 (-48) 通用引物测序。
PCR 引物使用正常设计的引物即可，不需做任何改变（不能用磷酸化引物）。任意 PCR 产物（兼容 A 末端 / 平末端）均可以直接连接。PCR 产物一般建议做回收纯化（货号：DR01），这样可以避免后续可能的问题。如果 PCR 产物同时有条带、无非特异性条带引物二聚体，也可尝试直接进行连接反应。如果是以质粒为模板的 PCR 产物则最好进行纯化，因为模板质粒也可能长出菌落（但不是想构建的目的载体）。
- 室温设立 10 μl 连接体系（建议用 0.2 ml PCR 管，PCR 仪器控温）：
| 试剂 |
用量 |
| 纯化后的 PCR 产物或者 1 μl 1000 bp Control |
0.5-5 μl |
| pTOPO-TA/Blunt Vector |
2 μl |
| 10 × Enhancer |
1 μl |
| 灭菌水 |
X μl |
| 总体积 |
10 μl |
加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底，注意此步骤不能在冰上进行，只能在室温（25℃-37℃）进行。
▲ 如果使用 5 μl 体系连接，各成分按照比例减半使用，使用次数可以加倍。
不同大小插入片段的推荐用量（注意过量太多了，反而导致转化子减少）：
- 37℃连接 5 分钟（建议置 PCR 仪器上控温）。
▲ 本载体推荐室温（25℃-37℃）5 分钟完成连接。长片段或者连接困难片段可以延长连接时间到 10-15 分钟，温度可选 37℃，可显著增加转化子数量。
- 连接产物置于冰上备用。立即接标准的感受态转化步骤或者快速转化步骤。
- 感受态细胞从 - 80℃拿出，迅速插入冰浴中，解冻融化（约 1-3 分钟左右）。
- 立刻加入 5 μl 连接液 (最多可 10 μl 连接液全加入，只要体积不超过感受态细胞体积的 1/10)，手指拨打 (Flick) 离心管底轻轻混匀 (避免用枪吸打)，冰浴放置 5 分钟。
- 热休克：42℃水浴热休克 60 秒，迅速放回冰浴静置 2-3 分钟，该过程不要摇动离心管。
▲ 本公司技术连接效率比竞争对手高 10-100 倍，所以如果后续发现转化子很多，甚至长满板子，做完热休克步骤后，可以省略步骤 4（复苏），直接将热休克冰浴后的感受态细胞涂板，培养过夜即可。这样从连接到涂板全过程仅需要 15 分钟，超快速流程极大的简化了操作，缩短了时间。
- 复苏（可选步骤）：加入 500 μl LB 或者 SOC 培养基 (不含抗生素)，37℃200 rpm 振荡培养 10-20 分钟。
▲ 根据我们的经验，一般可以直接将培养基（如从冰箱取出温度低，应事先置 37℃ 水温回温至 22-37℃）加入到感受态细胞的 1.5 ml 离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可，不需要转移到试管培养复苏。
▲ 一般商品化的感受态细胞不超过 2 kb 插入片段情况下，热休克后 10-15 分钟复苏可以得到足够多转化子，如果想使用实验室自制的感受态细胞、或者转化子少、插入片段长的情况下，可以提高复苏时间到 30-60 分钟以得到更多的转化子。
▲ 本公司技术连接效率比竞争对手高 10-100 倍，追求最简单最快速的用户可以尝试省略步骤 4（复苏），直接将热休克冰浴后的感受态细胞涂板，培养过夜即可。熟悉快速化流程后，以后这样从连接到涂板全过程仅需要 15 分钟，超快速流程极大的简化了操作，缩短了时间。
- 取 100-200 μl 菌液涂板 (培养板含氨benzylpenicillin 100 μg/ml)，培养过夜。
本制品采用自杀基因零背景原理，无插入自连的细菌会自杀无法生长，因此几乎没有假阳性，一般情况下，可以达到所见即所得，只要是长出来的菌落正常（不是污染的杂菌，转化子数量也不算太少），基本就 100% 包含插入。因此插入片段不超过 2-3kb 的情况下强烈建议不做菌落 PCR 鉴定，直接挑 1-2 个菌去测序。
- 一般本公司 TOPO 载体阳性率非常高，所以菌落生长正常，数量也不是太少的情况下建议直接去测序（强烈建议不做菌落 PCR 筛选）。注意测序引物不能采用 M13 (-47)/M13 (-48) 通用引物测序。
- TOPO 载体的菌落 PCR 结果容易出现假阴性（就是菌 P 失败显示没有插入或者扩增大小不对，实际却是有插入的）。因此在使用菌 P 鉴定的情况下，如果菌 P 结果阴性，一般可以相信此结果。如果结果是阳性，或者显示扩增出大小和预期不符合，一般不可信，要考虑到菌 P 结果假阳性的可能，需要直接去测序鉴定，测序成功的完成实验；测序不成功的可以进一步提取质粒跑电泳看大小，或者酶切鉴定来确认。
- 用上述培养的白色菌落的菌液抽提质粒，插入片段较大的情况下，直接跑电泳看质粒大小就直接能鉴定出有插入的质粒，还可用 EcoR I/Ecor V 单酶切释放插入片段或用其它合适的酶切，琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，确定是否含有目的片段。
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文献和实验
