pTOPO- ENTR/D 5分钟定向Gateway入门克隆

CV2001-pTOPO- ENTR/D 5分钟定向Gateway入门克隆构建试剂盒

产品介绍：
本制品采用了世界先进的Directional Topoisomerase Cloning（定向拓扑异构酶克隆技术）可以在5分钟内将待表达目的基因（高保真酶扩增的平末端片段）一步法定向克隆到Gateway入门载体（entry vector），得到的入门克隆（entry clone）可以和各种Gateway目的载体（destination vector）通过LR重组反应，生成表达克隆（expression clone）。方便目的基因在原核/哺乳动物细胞/酵母/昆虫表达系统切换表达。
1. 简单快速，加入待表达基因片段室温仅需5分钟便可完成入门克隆构建。
2. 定向克隆技术，超过90%插入为正确方向插入，减少克隆筛选耗费的时间。
3. 构建的入门克隆不含原核表达Shine-Dalgarno（SD)序列，因此构建原核表达克隆时应选择带SD序列的目的载体进行Gateway LR重组。 

测序可以采用 M13F/M13R 通用引物测序（见后面图谱）

目录号：CV20
 试剂盒组成、储存、稳定性：

                －20℃储存，至少 12 个月内不影响使用效果。

 操作步骤：
1. 待表达目的基因扩增引物设计原则：
(1) 为了达到定向克隆的目的，上游引物 5’端应该加上额外的 4 个碱基 CACC，这样 PCR 产物的 5’端可以和载体上突出的 GTGG 互补配对，从而达到定向克隆的目的。
举例：
待表达序列：5′ -ATG  GGA TCT GAT AAA ... 
设计上游引物：5 ′-CAC ATG GGA TCT GAT AAA ...
(2) 如果不计划和载体 C 端融合表达，则下游引物的起始端应该加上终止密码子（密码子序列应该为反向互补序列，例如终止密码子是 TGA，那么下游引物起始为 TCA）
(3) 如计划和载体 C 端融合表达，则下游引物的起始端应该不包含终止密码子；为达到定向克隆的目的，下游引物 5’起始应该不包含 CACC，这样可以避免 PCR 产物的3’端也可以和载体上突出的 GTGG 互补配对而造成错误方向的插入。
2. 连接反应的准备：
PCR引物不能磷酸化。使用扩增产物是平末端的高保真聚合酶系列扩增（如Pfu、Vent、Kod、 Phusion DNA Polymerase）。PCR产物建议胶回收纯化（货号：DR01)。
3. 连接反应：
1) 室温（20℃-30℃）按照如下体系操作（10l 体系）：

加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底，注意此步骤不能在冰上进行，只能在室温（20℃-30℃）进行。不同大小插入片段的推荐用量：

2) 室温（20℃-30℃）连接 5 分钟。
本载体推荐室温 5 分钟完成连接，但在很多情况下连接 2-3 分钟已经可以得到足够多的转化子。
3) 连接产物可直接转化克隆感受态细胞（如 DH5a，TOP10 等）或贮存于-20℃。如尚未准备好感受态细胞，可以将连接产物短时间置于冰上备用。
4. 转化：
1) 50-100l 感受态细胞，置于室温解冻，完全解冻后（约 1 分钟左右）轻掸几次将细胞均匀悬浮。
2) 加入 5l 连接液(最多可全部加入，只要体积不超过感受态细胞体积的 1/10)，轻轻混匀，室温放置 5 分钟。
根据我们的经验，本公司载体使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置 5 分钟便可获得足够多转化子，如果实验室自制感受态细胞或者效率较低时，可以按照标准程序进行。
3) 加 300-500l LB 或者 SOC 培养基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm 振荡培养 60 分钟。
根据我们的经验，一般可以直接将培养基（事先平衡至室温） 加入感受态细胞的 1.5 ml 离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可，
不需要转移到试管培养复苏。
4) 取 200l 菌液涂板，培养过夜（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000 rpm 离心 1 min，吸弃掉部分上清，保留 100-150l，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）
5. 转化子的筛选鉴定： 
1). 菌落 PCR 检测/提取质粒内切酶酶切鉴定阳性克隆。
2). 用 M13 通用引物测序，来确定是否含有目的克隆。

 pTOPO-ENTR/D 载体图谱：

 pTOPO-ENTR/D 载体克隆位点序列：