2、类器官传代培养 (1)移液器吸去培养基,每孔添加1-2ml 4℃类器官传代培养缓冲液 G 放置2min。 (2)移液抢轻柔吹打基质胶,收集在15ml离心管中,4℃静置10min。(每6-8孔为一组) (3)a:类器官数量不足或体积较小时: 离心5min弃去上清,添加适量类器官传代培养缓冲液 G 重悬移入1.5ml离心管,300g离心5min弃去液体进行第4步。 b:类器官数量较多或体积较大时:离心5min弃去上清,添加适量类器官传代消化液 D 消化2-3min,添加类器官传代培养缓冲液 G 终止消化,离心5min弃去混合液,添加适量类器官传代培养缓冲液 G 重悬移入1.5ml离心管,300g离心5min弃去液体进行第4步。 (4)类器官收集后,添加基质胶重悬,每孔25ul基质胶铺在24孔细胞培养板中,放置培养箱中10-15min添加500ul小鼠正常卵巢类器官培养基 A。
3、类器官冻存 (1)移液器吸去培养基,每孔添加1-2ml 4℃类器官传代培养缓冲液 G 放置2min。 (2)移液抢轻柔吹打基质胶,收集在15ml离心管中,4℃静置10min。(每6-8孔为一组) (3)离心5min弃去上清,添加适量类器官传代培养缓冲液 G 再次重悬,300g离心5min弃去液体。 (4)添加适量类器官冻存液 F,轻柔吹打重悬,以24孔细胞培养板为例:密度为2个孔冻存1管,每管体积1.4ml。 (5)做好标记信息,进行程序降温后,移入液氮长期保存。
4、类器官复苏 (1)取10ml类器官传代培养缓冲液 G 于15ml离心管中。 (2)从液氮罐中取出冻存的类器官细胞,快速置于 37℃水浴锅中融解。 (3)水浴融解过程中,需轻轻摇动冷冻管,以确保冻存液在 1-2min内完全融解。 (4)将溶解后的类器官细胞快速转移至15ml 离心管,使用移液管轻轻吹打6-8次,300g 离心 5min,然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量类器官传代培养缓冲液 G 重悬移入1.5ml离心管300g离心5min。 (5)基质胶重悬,每孔25ul基质胶铺在24孔细胞培养板中,放置培养箱中10-15min成胶,添加500ul小鼠正常卵巢类器官培养基 A。