Western及免疫沉淀用细胞裂解液

免疫共沉淀实验指南

将其稀释至 1 mg/mL 以降低缓冲体系中去污剂的浓度（但对于那些在细胞中表达水平较低的蛋白而言，10 mg/mL 这样更高的浓度可能对免疫沉淀更有效一些）。 加入推荐体积的免疫沉淀抗体至 500 µL 细胞裂解液中与目标蛋白反应。（抗体的最适用量要根据每一细胞模型中免疫沉淀靶蛋白的数量来确定）。 将细胞裂解液与抗体轻轻混匀后孵育 2h，或 4℃ 缓慢振荡过夜。（选择孵育 2h 常用于免疫沉淀与激酶或磷酸酯酶作用的活化酶。）加入100 µL Agarose protein A+G 轻轻振荡 1h

献给初学者：手把手教你做免疫共沉淀实验

获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30 min，细胞裂解液于 4 ℃，最大转速离心 30 min 后取上清； 取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液加 1 μg 相应的抗体加入到细胞裂解液，4 ℃ 缓慢摇晃孵育过夜； 取 10 μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次 3 000 rpm，离心 3 min； 将预处理过的 10 μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4 ℃ 缓慢摇晃孵育

免疫沉淀原理

裂解液将1 μg 相应的抗体和10~50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； 3. 免疫沉淀反应后，在4°C 以3 000 g 速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1 ml 裂解缓冲液洗3~4次；最后加入15 μl 的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟； 4. SDS-PAGE，Western blotting或进行质谱分析。 一、 样品