本试剂盒仅供科研使用
糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)试剂盒说明书
(货号:WS1121F 分光法 24 样)
一、产品简介:
糜蛋白酶(EC 3.4.21.1)又称胰凝乳蛋白酶,是胰腺分泌的一种蛋白水解酶,具有肽链
内切酶的作用,通过切断蛋白质肽链中酪氨酸、苯丙氨酸的羧端肽链作用,专一水解羧端芳
香族氨基酸。临床上糜蛋白酶用于痰液稀化,对脓性和非脓性痰液均有效;也用于创伤或手
术后伤口愈合。
糜蛋白酶可催化酪蛋白水解生成含酚的氨基酸,含酚的氨基酸与福林酚反应后显蓝色;
其颜色的深浅与胃蛋白酶活性呈正比。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称
规格
保存条件
备注
提取液
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉体 mg×1 瓶
4℃保存
临用前加 2.8mL 的试剂四,再加
5.6mL 的试剂二沸水加热,涡旋
振荡(反复几次)直到全部溶解,
再加 24mL 的试剂二混匀,配置
完的试剂 4℃保存,三天内用完。
试剂二
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
试剂三
液体 5mL×1 瓶
4℃保存
试剂四
液体 8mL×1 瓶
4℃保存
试剂五
液体 10mL×1 瓶
4℃保存
标准品
液体 2mL×1 支
4℃保存
质控品
粉体 mg×1 支
4℃保存
若用该试剂,则用前加 1mL 蒸馏
水溶解,再用蒸馏水稀释 10 倍,
即 0.1mg/mL 的糜蛋白酶。
三、所需的主要仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、台式离心机、可调式移液器、天平
四、糜蛋白酶活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。4℃×4000rpm 离心 5min,取
上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取
② 液体样本:液体用提取液按照 1:1 的比例混合稀释后,4℃×4000rpm,离心 5min,
取上清液检测。
2、上机检测:
① 可见分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 680nm,蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温。本试剂盒仅供科研使用
2
③ 在 EP 管中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
样本
100
100
试剂一
500
试剂三
100
37℃孵育 10min
试剂三
100
试剂一
500
37℃孵育 10min,4000rpm 室温离心 10min,上清液待测
④ 显色反应,在 EP 管中:
试剂名称(μL)
测定管
对照管
标准管
(只做一次)
空白管
(只做一次)
上清液
200
200
标准品
200
提取液
200
蒸馏水
200
200
200
200
试剂四
100
100
100
100
试剂五
200
200
200
200
37℃孵育 20min 后(若浑浊则室温 4000rpm 离心 5min),全部上清液转移至
1mL 玻璃比色皿中,于 680nm 处读取各管的吸光值 A。ΔA=A 测定-A 对照。
【注】1. 若ΔA 在零附近徘徊,可以延长反应时间 T(如 37℃孵育 10min 延长至 20min)或增加样本
量 V1(如增至 200μL,则试剂一相应减少),则改变后的反应时间 T 和样本量 V1 需代入计
算公式重新计算。
2. 若 A 测定值大于 1.5,可以减少样本量 V1(如减至 50μL,用提取液相应补充),则改变后
的样本量 V1 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、按样本蛋白浓度计算:
酶活定义:37℃每毫克蛋白每分钟催化酪蛋白水解生成 1μg 氨基酸为 1 个酶活单位(U)。
糜蛋白酶(U/mg prot)=[ΔA÷(A 标准-A 空白)×C 标准×V2]÷ (V1×Cpr) ÷T
=35×ΔA÷(A 标准-A 空白)÷Cpr
2、按样本鲜重计算:
酶活定义:37℃每 g 组织每分钟催化酪蛋白水解生成 1μg 氨基酸为 1 个酶活单位(U)。
糜蛋白酶(U/g 鲜重)=[ΔA÷(A 标准-A 空白)×C 标准×V2]÷(W×V1÷V) ÷T
=35×ΔA÷(A 标准-A 空白)÷W
3、液体中酶活力的计算:
酶活定义:37℃每毫升液体每分钟催化酪蛋白水解生成 1μg 氨基酸为 1 个酶活单位(U)。
糜蛋白酶(U/mL)=[ΔA÷(A 标准-A 空白)×C 标准×V2]÷V1÷T
=35×ΔA÷(A 标准-A 空白)
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---加入样本体积,0.1mL;
V2---第③歩反应总体积,0.7mL;
T---反应时间,10min;
C 标准---50μg/mL;
W---样本质量,g;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒