本试剂盒仅供科研使用
乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定试剂盒说明书
(货号:WS7090W 微板法 96 样)
一、产品简介:
乙酰胆碱酯酶(AChE,EC.3.1.1.7)是生物体内保证神经信号正常传递的关键酶,在
神经传导调节中起重要作用。
乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱(AChE)水解生成胆碱,胆碱与二硫对硝基*甲酸
(DTNB)作用生成 5-巯基-硝基*甲酸(TNB);TNB 在 412nm 处有吸收峰,通过测
定 412 nm 吸光度增加速率即可得出 AChE 酶活性大小。
二、试剂盒组成和配置:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 100mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 20mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂 mg×1 支
4℃保存
用前甩几下使试剂落入底部,再加
1.5mL 乙醇,充分溶解备用。
试剂三
粉剂 mg×2 支
4℃保存
用前甩几下使试剂落入底部,每支再
加 1.2mL 蒸馏水,充分震荡溶解。
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪。
四、乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称取约 0.1g 组织(水分充足的样本可取 0.5g),加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。
4℃×12000rpm 离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL
提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);
12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30 min,调节波长到 412 nm。
② 所有试剂可于 37℃水浴中孵育 20min 以上。在 96 孔板中依次加入:
试剂名称(
μL)
测定管
样本
20
试剂一
150
试剂二
10
试剂三
20
混匀,37℃条件下反应,30s 时于 412nm 处读取吸
光值 A1,5min30s 读取 A2,△A=A2-A1。本试剂盒仅供科研使用
2
【注】1.加完试剂三反应即启动;若 A1 值大于 1 或△A 大于 1,可减少样本体积 V1(如由 20μL
减至 10μL,则试剂一相应增加),或减少反应时间 T(如由 5min30s 减至 2min30s 读
A2),则改变后的 V1 和 T 重新代入公式计算。
2.若△A 低于 0.01,可增加样本取样量 W(如 0.2g),或加大样本体积 V1(如由 20μL 增
至 40μL,则试剂一相应减少),或延长反应时间 T(如由 5min30s 增至 15min30s 或更
长读 A2),则改变后的 W 和 V1 和 T 重新代入公式计算。
五、结果计算:
1. 按照蛋白浓度计算:
酶活定义:每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。
AChE 酶活(nmol/min/mg prot)=(△A÷ε÷d×V2×109)÷(Cpr×V1)÷T=294.12×△A÷Cpr
2. 按照样本质量计算:
酶活定义:每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。
AChE 酶活(nmol/min/g 鲜重)=(△A÷ε÷d×V2×109)÷(W×V1÷V)÷T=294.12×△A÷W
3. 细菌、细胞 AchE 活性:
酶活定义:每 104个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。
AChE 酶活(nmol/min/104 cell)=(△A÷ε÷d×V2×109)÷(500×V1÷V)÷T=0.6×△A
4. 液体中 AchE 活性:
酶活定义:每毫升血清每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。
AChE 酶活(nmol/min /mL)=(△A÷ε÷d×V2×109)÷V1÷T=294.12×△A
ε---TNB 摩尔消光系数,13.6×103 L/mol/cm;
d---96 孔板光径,0.5 cm;
V---提取液体积,1 mL;
V1---加入上清液体积,0.02 mL;
V2---反应体系总体积,200μL=2×10-4L;
T---反应时间,5min;
W---样本取样质量,g;
500---细菌或细胞数量,万;
Cpr---蛋白浓度(mg/mL);建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。