本试剂盒仅供科研使用
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGDH)试剂盒说明书
(货号:WS4180F 分光法 48 样)
一、产品简介:
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGDH,EC 1.1.1.43)是磷酸戊糖途径中关键酶之一,在维
持细胞 NADPH 水平上起重要作用,与生物体能量平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。
本试剂盒提供一种简单,灵敏,快速的测定方法:6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化 6-磷酸
葡萄糖酸和 NADP+生成 NADPH。进而与特异显色探针反应生成有色物质,通过检测该
有色物质的增加速率,计算出 6-PGDH 酶活性大小。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 50mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂 mg×1 瓶
4℃保存
用前甩几下使粉剂落入底部(量少,勿
损失),再加 17.5mL 试剂一充分溶解,
用不完的试剂 4℃保存;
试剂三
液体 1mL×EP 管
4℃保存
标准品
粉剂 mg×1 支
-20℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂
三、所需的仪器和用品:
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径 1cm)、低温离心机、水浴锅、可调式移液
枪、和蒸馏水。
四、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGDH)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min,取上
清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取
② 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 可见分光光度计预热 30min 以上,设置温度 25℃,调节波长至 450nm,蒸馏水调零。
② 试剂解冻至室温(25℃);
③ 在 1mL 玻璃比色皿中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
样本
80
试剂一
360
试剂二
340
试剂三
20
混匀,25℃条件下,立即于 450nm 处读取 A1 值,20min
后读取 A2 值,(观察:酶活性越大,则黄色越明显)。
ΔA=A2-A1。
【注】:若ΔA 过小,可以延长反应时间(如:60min 或更长)再读取 A2,或加大本试剂盒仅供科研使用
2
样本取样量(如增加到 0.2g),重新调整的反应时间 T 需代入计算公式重新计
算。
五、结果计算:
1、标准曲线方程:y = 0.028x - 0.0015,x 是 NADPH 摩尔质量(nmol),y 是ΔA。
2、按蛋白浓度计算
酶活定义:每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。
6PGDH(nmol/min /mg prot) = [(ΔA+0.0015) ÷0.028]÷(Cpr×V1)÷T
=22.3×(ΔA+0.0015)÷Cpr
3、按样本质量计算
酶活定义:每克组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。
6PGDH 酶活性(nmol/min/g 鲜重) =[(ΔA+0.0015) ÷0.0795]÷(V1÷V×W)÷T
=22.3×(ΔA+0.0015)÷W
4、按液体体积计算
酶活定义:每毫升液体每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。
6PGDH 酶活性(nmol/min/mL)= [(ΔA+0.0015) ÷0.0795]÷V1÷T
= 22.3×(ΔA+0.0015)
V----加入提取液体积,1 mL;
V1----加入样本体积,0.08 mL;
W----样本质量,g。
T----反应时间,20 min;
Cpr----样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(1nmol/μL):向标准品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸馏水(母液需在两
天内用且-20℃保存)。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5. nmol/μL。也可根据实
际样本来调整标准品浓度。
3 按照 80μL 标准品+700μL 试剂一+20μL 试剂三,根据结果即可制作标准曲线。