本试剂盒仅供科研使用
NAD-苹果酸酶（Malic enzyme , NAD-ME）试剂盒说明书
（货号：WS9180F 分光法 48 样）
一、产品简介：
苹果酸酶是生物体内重要的酶之一，广泛存在于动物、植物、细菌体中。是苹果酸代谢的
关键酶。近年来植物 ME 活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。该酶发挥作用需要辅
酶因子的参与，依据辅酶因子的不同，分为 NAD-ME(EC 1.1.1.38)和 NADP-ME(EC 1.1.1.40)。
ME 的主要功能是催化苹果酸氧化脱羧产生丙*酸和 CO2，以及伴随 NAD(P)+的还原反应，
NADP-ME 催化 NAD+还原成 NADH，本试剂盒通过检测 NADH 在 340nm 处的增加速率即
可得出 NAD-ME 的酶活性大小。
二、试剂盒的组成和配制：
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 50mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂 mg×1 支
-20℃保存 用前甩几下或离心使试剂落入 底部，再加
1.2mL 蒸馏水溶解。
试剂二
粉剂 mg×1 支
4℃保存
用前甩几下或离心使试剂落入
底部，再加 1.2mL 蒸馏水溶解。
试剂三
粉剂 mg×1 支
4℃保存
用前甩几下或离心使试剂落入
底部，再加 1.2mL 蒸馏水溶解。
试剂四
液体 40mL×1 瓶
4℃保存
试剂五
粉剂 mg×1 支
4℃保存
用前甩几下或离心使试剂落入
底部，再加 1.2mL 蒸馏水溶解。
三、所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅、台式离心机、可调式移液
器、蒸馏水。
四、NAD-苹果酸酶（NAD-ME）活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验
样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：
称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，
取上清，置冰上待测。
【注】：按照组织质量（
g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例。
② 细菌/培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或
细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声
3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按细菌/细胞数量（104个）：提取液（mL）为 1000~5000：1 的比例进行提取
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液体样品：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
② 所有试剂放在 25℃水浴 10min；
③ 试剂二、三和四可按照操作表加样体系以 20:20：680 的比例混合，一次性取出 720μL。
④ 在 1mL 玻璃比色皿中依次加入：本试剂盒仅供科研使用
2
试剂名称（μL）
测定管
样本
40
试剂一
20
试剂二
20
试剂三
20
试剂四
680
试剂五
20
混匀，立即于 340nm 下读取 A1 值，室温
（25℃）下，3min 后读取 A2 值。ΔA=A2-A1。
【注】若ΔA 过小，可以延长反应时间 T（如：10min 或更长），或增加样本上样量 V1（如
增至 60μL，则试剂四相应减少），重新调整的 T 或 V1 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：25℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。
NAD-ME(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d) ×V2×109]÷(Cpr×V1)÷T
=1071.8×ΔA÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
酶活定义：25℃条件下，每克组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。
NAD-ME(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d) ×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T
=1071.8×ΔA÷W
4、按细菌/细胞密度计算：
酶活定义：25℃条件下，每 1 万个细菌/细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。
NAD-ME(nmol/min/104 cell)=[ΔA÷(ε×d) ×V2×109]÷(V1÷V×500)÷T=2.14×ΔA
5、按照液体体积计算：
酶活定义：25℃条件下，每毫升液体每分钟生成 1nmol NADH 定义为一个酶活单位。
NAD-ME(nmol/min/104 cell)=[ΔA÷(ε×d) ×V2×109]÷V1÷T=1071.8×ΔA
ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol；
V---加入提取液体积，1 mL；
V1---加入样本体积，0.04mL；
V2---反应总体积，800μL =8×10-4L；
T---反应时间，3min；
W---样本质量；
d---光径，1cm；
500---细菌或细胞总数，500 万；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
文献和实验
