本试剂盒仅供科研使用
异柠檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）试剂盒说明书
（货号：WS7680W 微板法 96 样）
一、产品简介：
异柠檬酸裂解酶（ICL，EC4.1.3.1）是乙醛酸循环的关键酶之一，主要存在于植物和微
生物中；在油料作物种子在萌发过程中，通过脂肪酸的β-氧化和乙醛酸循环将脂肪酸转变
成碳水化合物。因此测定 ICL 活性对了解油类种子的代谢途径和物质转化，以及种子活
力情况有重要意义。
异柠檬酸裂解酶（ICL）催化分解异柠檬酸形成一分子琥珀酸和一分子乙醛酸。乙醛酸
和二硝基*肼形成乙醛酸*肼，且在碱性条件下显褐色，其颜色深浅与乙醛酸含量呈正比。
因此可以用比色法测定乙醛酸含量，进而计算得出 ICL 活性。
该酶催化反应：isocitrate = succinate + glyoxylate。
二、试剂盒的组成和配制：
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 100mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 20mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂 mg×1 瓶
4℃保存
临用前甩几下使粉剂落入底部，
再加 5mL 试剂一溶解备用；
试剂三
液体 4mL×1 瓶
4℃保存
试剂四
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉剂 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲，则用到该试剂
三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、低温台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、异柠檬酸裂解酶（ICL）活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验
样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：
称取约 0.1g 组织（水分含量高的样本可取约 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，
12000rpm，4℃离心 15min，取上清置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（
g）：提取液体积(mL)为 5~10：1 的比例进行提取
② 细菌/细胞样本：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL
提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；
12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 445nm。
② 所有试剂解冻至室温。
③ 在 96 孔板中依次加入：
试剂名称（
μL）
测定管
对照管
样本
10
试剂一
50
50本试剂盒仅供科研使用
2
试剂二
20
20
混匀，于 30℃孵育 30min
试剂三
20
20
样本
10
混匀，于 30℃孵育 10min
试剂四
150
150
混匀，25℃孵育 5min，立即于 445nm 处读取吸光值 A（15min
内完成检测），△A=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。
【注】1.若 A 测定超过 1.8，可降低样本量 V1（如 5μL，另外 5μL 用蒸馏水补齐，总体积 10μL
保持不变）。则改变后的加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。
2.若△A 的值在零附近徘徊，则可增加样本量 V1（如 30μL，则试剂一相应减少），或增
加样本取样质量（W），则改变后的加样体积 V1 和取样质量 W 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、标准曲线方程：y = 0.0599x - 0.0017，x 是标准品摩尔质量（nmol），y 是△A。
2、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：每毫克组织蛋白每小时裂解 1nmol 异柠檬酸生成 1nmol 乙醛酸为一个酶活单位。
ICL(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0017)÷0.0599]÷(V1×Cpr)÷T=3338.9×(ΔA+0.0017)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
酶活定义：每克组织每小时裂解 1nmol 异柠檬酸生成 1nmol 乙醛酸为一个酶活力单位。
ICL(nmol/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0022)÷0.0599]÷(W ×V1÷V)÷T=3338.9×(ΔA+0.0017)÷W
4、按细菌/细胞密度计算：
酶活定义：每 1 万个细菌/细胞每小时裂解 1nmol 异柠檬酸生成 1nmol 乙醛酸为一酶活单位。
ICL(nmol/h/104 cell)=[(ΔA+0.0022)÷0.0599]÷(500×V1÷V)÷T=6.68×(ΔA+0.0017)
V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.01mL； 标准品 Mr---92.05；
T---反应时间，30min=0.5h； W---样本质量，g；
500---细胞数量；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1 制备标准品母液（1mg/mL）：临用前加 1mL 蒸馏水溶解，（母液需在两天内用且-20℃
保存）。
2 把母液稀释成以下浓度：0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1mg/mL。也可根据实际来调整浓
度。
3 依据测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。
文献和实验
