本试剂盒仅供科研使用
Ca2+ - ATP 酶活性测定说明书
(货号:WS0680W 微板法 48 样)
一、产品简介:
Ca2+是细胞内重要的信号分子,细胞质基质始终维持在一个较低水平的 Ca2+浓度,Ca2+
浓度的维持主要由 Ca2+-ATP 酶来维持,该酶可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机磷。通过
测定无机磷的量来确定该酶活性高低。
二、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
三、试剂盒的组成和配制:
【注】:全程操作需无磷环境;试剂配置最好用新的枪头和玻璃移液器等,也可以用一次性塑料器皿,避
免磷污染。
四、Ca2+-ATP 酶活性检测:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。 4℃×12000rpm 离心 10min,取
上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500 万细菌或细胞加入 1mL
提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);
12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 700nm,所有试剂解冻至室温(25℃)。
② 在 EP 管中依次加入:
试剂名称(
μL)
测定管
对照管
试剂一
100
提取液
100
样本
100
试剂二
100
100
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
提取液 80mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉体 mg×1 瓶
4℃保存
用前甩几下使试剂落入底部,再加
8mL 提取液,混匀溶解备用。
试剂二
粉体×1 瓶
-20℃保存
用前甩几下使试剂落入底部,再加
15mL 提取液,混匀溶解备用。
试剂三
液体 4mL×1 瓶
4℃保存
试剂四
A:粉体 mg×1 瓶
B:液体 2mL×1 瓶
4℃保存
临用前在试剂 A 中加 1.8mL 的 B 液,
再加23.2mL的蒸馏水,混匀溶解备用。
标准品
粉体 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂本试剂盒仅供科研使用
2
37℃ 孵育 20min
试剂三
40
40
样本
100
混匀,12000rpm,4℃离心 5min,上清液待测
③ 显色反应:
五、结果计算:
1、标准曲线方程:y = 0.6402x - 0.0034,x 是标准品摩尔质量(
μmol/mL), y 是△A。
2、按蛋白浓度计算:
定义:每小时每毫克组织蛋白分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(V1×Cpr)÷T
=15.93×(△A+0.0034)÷Cpr
3、按样本鲜重计算:
定义:每小时每克组织分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(W×V1÷V)÷T
=15.93×(△A+0.0034)÷W
4、按细菌或细胞密度计算:
定义:每小时每 1 万个细菌或细胞分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h /104 cell)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.032×(△A+0.0034)
5、液体中 Ca2+-ATPase 活力计算:
定义:每小时每毫升液体分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷V1÷T=15.93×(△A+0.0034)
V---加入提取液体积,1mL;
V1---加入样本体积,0.1mL ;
V2---酶促反应总体积,0.34mL;
T---反应时间,1/3 小时;
W---样本鲜重,g;
500---细菌或细胞总数,万;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附:标准曲线制作过程:
1
制备标准品母液(
5μmol/mL):标准品用 10mL 试剂一溶解。(母液需在两天内用)。
2
把母液稀释成六个浓度梯度的标准品:0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整
标准品浓度。
3
依据显色反应阶段测定管的加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。
上清液
50
50
试剂四
200
200
混匀,室温静置 3min,700nm 下读取各管吸光值,
△A=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。