本试剂盒仅供科研使用
糖原合酶(Glycogen synthase,GCS)试剂盒说明书
(货号:WS2650W 微板法 96 样)
一、产品简介:
糖原合酶(GCS,EC 2.4.1.11)将 UDP-G 糖基加到葡萄糖残基上,以α-1,4-糖苷键相
连延长糖链,GCS 是糖原合成的限速酶,对糖代谢和血糖稳态的维持具有重要作用。
GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP,*酮酸激酶和乳酸脱氢酶的逐一作用
下,使NADH氧化为NAD+,通过检测NADH在340nm处的下降量来计算GCS酶活大小。
二、试剂盒组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 100mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
粉剂 mg×1 支
-20℃保存
临用前甩几下使粉剂落入底部,再
加 1.2mL 蒸馏水充分溶解备用。
试剂二
粉剂 mg×4 支
-20℃保存
每支用前甩几下使试剂落入底部,
再加 0.3mL 的蒸馏水溶解备用。用
不完的试剂分装后-20℃保存,禁止
反复冻融,三天内用完。
试剂三
粉剂 mg×1 支
-20℃保存 临用前甩几下使粉剂落入底部,再 加
1.2mL 蒸馏水充分溶解备用。
试剂四
液体 15mL×1 瓶
4℃保存
试剂五
粉剂 mg×1 支
-20℃保存
临用前甩几下使粉剂落入底部,再
加 1.2mL 蒸馏水充分溶解备用。
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、糖原合酶(GCS)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心 15min,取上
清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取
② 细胞样本:
先收集细胞到离心管内,离心后弃上清;取 500 万细胞加入 1mL 提取液;超声波破
碎细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);4ºC 约 12,000rpm
离心 10min,取上清作为待测样品。
【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30min 以上,设置温度 30℃,调节波长至 340nm。
② 试剂放在 30℃水浴 5min;
③ 在 96 孔板中依次加入:本试剂盒仅供科研使用
2
试剂名称(μL)
测定管
样本
20
试剂一
10
试剂二
10
试剂三
10
试剂四
140
混匀,30℃下孵育 5min。
试剂五
10
混匀,30℃下,2min 时于 340nm 处读取吸光
值 A1,22min 时读取 A2,△A=A1-A2。
【注】:1.若ΔA 过小,可以延长反应时间(如:32min 或更长)再读取 A2,或增加样本加样量 V1(如
增至 40μL,则试剂四相应减小),重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
2.若 A2 值小于 0.45,则需缩短反应时间 T(如减至 12min)再读取 A2 或减少样本量 V1(如减
至 10μL,则试剂四相应增加),重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、按样本蛋白浓度计算
单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=160.8×ΔA÷Cpr
2、按样本鲜重计算
单位定义:每克组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GCS(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=160.8×ΔA÷W
3、按细胞密度计算
单位定义:每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
GCS(nmol/min/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.323×ΔA
ε---NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;
d---96 孔板光径,0.5cm;
V---加入提取液体积,1 mL;
V1---加入样本体积,0.02mL;
V2---反应体系总体积,2×10-4 L;
T---反应时间,20 min;
W---样本质量,g;
500---细胞数量;
Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。