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- 2025年07月09日
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免疫荧光验证自噬流
LC3是酵母自噬关键蛋白ATG8在哺乳动物中的同源蛋白。LC3最初被分析鉴定为microtubule-associated protein 1 light chain 3 (MAP1LC3)。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亚家族，其中对于LC3B的研究最为广泛。到目前为止，LC3B被认为是细胞自噬信号通路最为关键的标志性蛋白。LC3B是一个具有125个氨基酸残基的蛋白，在蛋白合成后， 被Atg4所酶切而失去了C端的22个氨基酸蛋白，从而暴露出C端的甘氨酸，人们把它命名为胞质形式的LC3B I。在细胞自噬的过程中，其C端暴露的甘氨酸经过一个类似泛素化的过程，以ATG7为E1样激活酶(E1-like activating enzyme)，以ATG3为E2样连接酶(E2-like conjugation enzyme)，以Atg12-Atg5-Atg16复合物为E3样连接酶(E3-like ligase)，在C端甘氨酸上共价连接上磷脂酰YI醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)而成为LC3B-PE即LC3B II。与胞质定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬体(autophagosome)的内膜和外膜上。在自噬体与溶酶体融合后，自噬体外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬体内膜上的LC3B II则被溶酶体内的蛋白酶所降解。尽管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其极强的疏水性，在SDSPAGE电泳时，LC3B II比LC3B I迁移得更快，其表观分子量分别为14kD和16kD。自噬(Autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。自噬与多种生理功能有关，在饥饿等不利的环境条件下，细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内组分，为细胞的生存提供能量及原材料，促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产生应答。自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。由于细胞自噬在生理和病理过程中都有重要作用，自噬已经成为细胞生物学领域的一个新的研究热点。
GFP-LC3B是重组慢病毒，感染后能够在靶细胞中有效表达绿色荧光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈现明亮的绿色荧光，可以用于细胞自噬的检测。
RFP-GFP-LC3B是研载生物研发的重组慢病毒，感染后能够在靶细胞中有效表达红色荧光蛋白(RFP)、绿色荧光蛋白(GFP) 和LC3B的融合蛋白，呈现明亮的红色和绿色荧光，可以用于细胞自噬的检测。自噬小体在与溶酶体融合过程中，溶酶体内的酸性环境会导致GFP荧光淬灭，这为追踪GFP-LC3B的细胞定位增加了难度。RFP是一种红色荧光蛋白，当其与GFP进行LC3B的共同标记时，在GFP被溶酶体酸性环境所淬灭的情况下，可以发出红色荧光的RFP因为其卓越的稳定性而被保留。 因此，通过融合表达RFP-GFP-LC3B蛋白，可以非常有效地追踪自噬过程。在用RFP-GFP-LC3B慢病毒感染细胞后，在非自噬的情况下，荧光显微镜下RFP-GFP-LC3B以弥散的黄色荧光(RFP和GFP的综合效果)形式存在于细胞质中；而在自噬的情况下，荧光显微镜下RFP-GFP-LC3B则聚集在自噬体膜上，以黄色斑点的形式表现出来(LC3B dot or punctae)；当自噬体与溶酶体融合后，因GFP荧光的部分淬灭而以红色斑点的形式表现出来。
实验流程
1. 构建含有LC3B基因的重组载体。
2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒。
3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液。
4. 浓缩、纯化病毒液。
5. 用高质量的病毒液感染宿主细胞或进行稳定转染细胞株的筛选（筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性）；使用药物处理或者siRNA沉默细胞。
6. 免疫荧光标记。
7. 先在荧光显微镜下观察确认标记成功，然后移至共聚焦显微镜下进行观测。
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文献和实验Nature Medicine 再论多重免疫荧光揭示预测性生物标志物，用于优化免疫治疗临床试验设计
的队列的缓解率和 PFS 均显著高于 PEMBROSARC 研究的先前所有患者队列（分别为 30% 对 2% 和 4.9 对 1.5 个月）。这些结果与此前对 SARC028 研究中肿瘤样本的回顾性分析结果一致，表明晚期软组织肉瘤（STS） 中 TLS 的存在是一种潜在的预测生物标志物，可改善患者对派姆单抗治疗的选择。 在PEMBROSARC 研究的临床试验设计中，研究者基于600 多个 STS样本的转录组数据定义了一个“高免疫”的肉瘤亚组，并使用多色免疫荧光验证样本中的肿瘤内 TLSs的组织特征
越来越多的证据表明多重荧光免疫组化 (multiplex immunohistochemistry, mIHC)，又称多重免疫荧光 (multiplex immunofluorescence, mIF) 技术的稳健性和预测价值。利用多重荧光免疫组化（mIHC）/ 多重免疫荧光（mIF）进行多重成像的空间生物标志物分析有望在发现研究和临床阶段的研究中得到广泛采用。 越来越多的实验室报道正在使用 Opal 多重荧光免疫组化优化为可重复的工作流程，为该技术的稳健性和预测价值提供了很多证据
Nature Cancer I 生物标志物多参数评估mTLS预测实体瘤免疫治疗效果
知名制药企业，CRO 公司，研究所等多家著名机构以多重免疫荧光整体方案为主要方法，对三个不同类型癌症患者的独立样本进行大规模回顾性分析，发现： (1) 较高密度的三级淋巴结构 (TLS) 的高密度性与 CD8+ T 淋巴细胞肿瘤浸润密度相关，是细胞杀伤性免疫反应激活的特征; (2) B 细胞和成熟 TLS 可预测接受免疫检查点抑制剂治疗的患者的预后; (3) 泛肿瘤/“肿瘤不可知”生物标志物：TLS 在 11 种不同肿瘤类型中的存在与 PDL-1 轴阻断功效相关； (4)为了更可靠地评估
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