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- RIP 技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 结合蛋白免疫沉淀）主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。RIP 是研究细胞内RNA 与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。
- 2025年12月24日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 服务名称：
CHIP实验(染色质免疫沉淀法 )
- 提供商：
上海威奥
用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。防止非特异性的RNA的结合。免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。
RIP 技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 结合蛋白免疫沉淀）主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。RIP 是研究细胞内RNA 与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同，如：RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等。
RIP实验步骤
一、获取细胞裂解液
- 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次
- 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至eppendoff管
- 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞
- 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min
- 每管分装200μl细胞裂解液，贮存于-80℃
二、制备磁珠-抗体
- 重悬磁珠
- 标记实验所需的eppendoff管
- 吸取50μl 重悬后的磁珠悬液于每个eppendoff管
- 每管加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡
- 将eppendoff管置于磁力架上，去上清，重复一次
- 用100μl的RIP Wash Buffer重悬磁珠
- 室温孵育30min
- 将eppendoff管置于磁力架上，弃上清
- 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次
- 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上
三、RNA结合蛋白免疫沉淀
- 准备RIP Immunoprecipitation Buffer
- 将前上步的eppendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
- 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，离心。吸取100μl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml
- 4℃孵育3h至过夜
- 短暂离心，将eppendoff管放在磁力架上，弃上清
- 加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将eppendoff管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次
四、RNA纯化
- 准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul
- 用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物
- 55℃孵育30min
- 孵育完之后，将enpendoff管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff管中
- 于每管上清液中加入250μl RIP Wash Buffer
- 于每管加入400μl苯酚：氯仿：异戊纯，涡旋震荡，室温下14,000rpm离心10min
- 小心吸取350μl上层水相，吸入另一新的enpendoff管
- 于每管加入400μl氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min
- 小心的吸取300μl上层水相，吸入另一新的enpendoff管
- 每管加入50μl Salt SolutionⅠ，15μl Salt SolutionⅡ,5μl Precipitate Enhancer ，850μl 无水乙醇（无RNase），混合，-80℃保持1h至过夜
- 14,000rpm，4℃离心30min，小心去上清
- 用80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4℃离心15min，小心去上清，空气中晾干.
- 10-20μl DEPC水溶解，-80℃保存
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文献和实验抗体基础实验学习视频系列之三染色质免疫共沉淀实验（CHIP）视频教程，详细演示从裂解液制备到 DNA 定量的全过程。
在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DN***段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。对于刚刚开始使用ChIP技术的研究人员来说，使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服务会达到事半功倍的效果，比如Millipore公司的EZ-ChIP试剂
ChIP是一种强大的确定蛋白或者组蛋白修饰在基因组上定位的实验方法。染色质被分离出来后采用抗体与抗原的结合来判定目的蛋白是否结合在特定的DNA序列上或者判定目的蛋白结合位点在全基因组范围的分布（微阵列或DNA序列）。这种方法具有空间性与时效性。该实验设计为如何在细胞中进行ChIP实验提供了详细的步骤。1. 交联和细胞收获甲醛可以将蛋白质交联到DNA上。交联结果的好坏决定于交联时间的把握。我们建议样品交联的时间一般为2-30分钟。过度的交联会减少抗原的结合性和超声断裂的效率。抗原决定簇也会被掩盖
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