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- 探针是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500 bp），用于检测与其互补的核酸序列。
- 浙江省
- 2025年07月09日
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- 提供商：
XSL
- 服务名称：
探针合成
实验材料 基因
试剂、试 剂盒 转录缓冲液 DTT RNA酶抑制剂 CTP ATP S-UTP 乙酸铵 乙醇
仪器、耗 材 水溶锅 离心机 培养箱 烘箱
实验步骤
- 在一个含SP6、T3或T7启动子的载体中，插入目的基因。在编码序列下游酶切使质粒呈线性。DNA以酚/氯0 仿抽提，乙醇沉淀，70%乙醇洗后晾干。以无菌水重溶沉淀至1 μg/μl。
- 室温配罝如下反应混合液（总体积20 μl）：
（2）0.2 μl 1 mol/l DTT
（3）60 U RNA酶抑制剂
（4）1.0 μl 三种10 mmol/l NTP中的每一种
（5）1.0 μl 1 μg/μl 酶切DNA
（6）10.0 μl ［35S］UTP
（7）16 U SP6或T7 RNA聚合酶
（8）37℃温育30 min，再加16 U聚合酶并于37 ℃温育40 min。
- 在反应混合液中加入：60 U RNA酶抑制剂，20 μl 10 mg/ml 的载体RNA和1.0 μl 酶1，于37℃温育10 min 以 除去摸板。
- 往反应混合液加入以下液体：0.8 μl 1 mol/l DTT、63 μl 无菌水和10 μl 3 mol/l 乙酸钠，取出1 μl 测定其 cpm/ μl 值。
- 加36.4 μl 7.5 mol/l的乙酸铵于反应混合液（终浓度2 mol/l）加50~100 μg tRNA载体和272 μl 冷无水乙醇，置 干冰上沉淀10 min，以冷70%乙醇洗沉淀，晾干，需要的话可重复此步。以100 μl 10 mmol/l DTT重溶DNA沉 淀。
- 确定其 cpm/μl 值，并计算掺入百分比，核糖核酸探针应于2~3天内使用。 （70%到90%的标记掺入，结果可 得70~90 ng 标记的RNA）。
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文献和实验利用寡核苷酸自动合成仪，可很简单地合成制备寡核苷酸探针（如15～50bp），类探针具有以下优点：①短的探针比长探针杂交速度快，特异性强。②可以在短时间内大量制备。③在合成中进行标记制成探针。④可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。因此，寡核苷酸探针的研究，对于提高核酸杂交技术的特异性和敏感性，扩大应用范围有重要意义。常用的寡核苷酸探针有3种：①特定序列的单一寡核苷酸探针；②
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注意RNAse的防污染操作。 制备RNA探针的常用方法是构建含探针标记模板的重组质粒，将克隆子的转录区下游进行限制性酶切线性化后，进行体外转录的探针合成反应。当然，采用的质粒上必须含有SP6，T3或T7 RNA聚合酶的启动子序列。体外转录法合成的探针量很大，通常情况下，1μg的DNA模板进行反应，将得到20μg的标记RNA探针。 另一种更加直接的体外转录标记法，是先通过PCR方法制备DNA探针模板。扩增引物需要特殊设计，包含SP6，T3或T7 RNA聚合酶的启动
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