本试剂盒仅供科研使用
脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase)试剂盒说明书
(货号:WS2120F 紫外法 48 样)
一、产品简介:
脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR,EC 1.8.5.1)又名谷胱甘肽脱氢酶(抗坏血酸)
(Glutathione Dehydrogenase (ascorbate)),存在于叶绿体、线粒体和细胞质中,是 AsA-GSH
循环中重要的酶,对维持细胞中抗坏血酸还原能力有重要作用。
DHAR 催化 GSH 还原 DHA 生成 AsA 和 GS SG,本试剂盒通过在 265nm 下检测 AsA
的生成速率来计算 DHAR 的酶活性大小。
二、试剂盒组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 30mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂 mg×1 瓶
4℃保存
用前甩几下或 4℃离心使试剂落入
试管底部,再加 4.4mL 蒸馏水溶
解。
试剂三
粉剂 mg×1 瓶
4℃保存
用前甩几下或 4℃离心使试剂落入
试管底部,再加 4.2mL 蒸馏水溶
解。
三、所需的仪器和用品:
紫外分光光度计、1mL 石英比色皿(光径 1cm)、低温离心机、可调式移液器、研钵
四、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样
本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm,4℃离心 10min,取
上清,置冰上待测。
【注】:若增加样本量,可按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例进行提取
② 液体样本:直接测定。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测:
① 紫外分光光度计预热 30 min,调节波长到 265nm,蒸馏水调零。
② 试剂一在 25℃水浴锅中预热 30 min。
③ 在 1mL 石英比色皿中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
样本
40
试剂一
600
试剂二
80
试剂三
80
轻轻混匀,在 265nm 处,10S 和 3min10S 分
别读值,相应记为 A1 和 A2,△A=A2-A1。
【注】1.若△A 的值在零附近,可以适当延长反应时间到 10min10s 读取 A2,改变后的反应时间需代
入计算公式重新计算。或适当加大样本量,则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。本试剂盒仅供科研使用
2
2. 若起始值 A 太大如超过 2(如颜色较深的植物叶片,一般色素较高,则起始值相对会偏高),
可以适当减少样本加样量,则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。
3. 若上升趋势不稳定,可以每隔 10S 读取一次吸光值,选取一段线性上升的时间段来参与计
算,相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、 按蛋白浓度计算
活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V2×109)÷(Cpr×V1)÷T
= 123×△A ÷Cpr
2、按样本质量计算
活性单位定义:25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR(nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V2×109÷(W×V1÷V)÷T
= 123×△A ÷W
3、按液体体积计算
活性单位定义:25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。
DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V2×109÷V1÷T
= 123×△A
ε ---AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×104 L/mol /cm;
d ---96 孔板光径,1cm;
V ---提取液体积,1 mL;
V2 ---反应体系总体积,800μL=8×10-4 L;
V1 ---加入样本体积,40μL =0.04mL;
W---样品质量;
T ---反应时间,3min;
Cpr---上清液蛋白浓度,mg/mL,建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。