本试剂盒仅供科研使用
6-磷酸海藻糖酯酶（TPP）试剂盒说明书
（货号：WS2850W 微板法 48 样）
一、产品简介：
6-磷酸海藻糖酯酶（trehalose-6-phosphatephophatase，TPP，EC3.1.3.12）是海藻糖合
成的关键酶之一，催化海藻糖-6磷酸生成海藻糖。
本试剂盒利用 6-磷酸海藻糖酯酶催化底物 6-磷酸海藻糖生成海藻糖，海藻糖在海藻
糖酶的作用下分解成葡萄糖，接着在葡萄糖氧化酶作用下与特异显色剂反应生成有色物
质，通过检测该有色物质在 520nm 处的值，即可得出的 6-磷酸海藻糖酯酶活性大小。
二、试剂盒组成和配制：
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 60mL×1 瓶
4℃保存
试剂一
液体 8mL×1 瓶
4℃保存
试剂二
粉剂 mg×1 支
-20℃保存
临用前甩几下使粉剂落入底部，再加入
1.1mL 蒸馏水溶解备用。用不完的试剂
分装后-20℃保存，尽量不要反复冻融。
试剂三
液体 1mL ×1 支
-20℃保存
试剂四
粉剂 mg×1 支
-20℃保存
临用前甩几下使粉剂落入底部，再加入
1.1mL 蒸馏水溶解备用。
试剂五
液体 15mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉体 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲，则用到该试剂。
三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱/金属浴、可调式移液器、研钵、冰。
四、6-磷酸海藻糖酯酶（TPP）活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实
验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织样本（水分足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，冰
浴匀浆，12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（
g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。
② 细菌/真菌样本：
先收集细菌或真菌到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或真菌加入 1mL 提取
液；冰浴超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复
30 次），室温晃动提取 30min， 8000rpm 室温（25℃）离心 10min，取上清。
【注】：若增加样本量，可按照提取液体积(mL) ：细菌或真菌数量（104个）为 1：500~1000 的比例提取
③ 液体样本：澄清的液体样本，可直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 520nm，所有试剂解冻至室温（25℃）。
② 在 EP 管中依次加入：
试剂名称（
μL）
测定管
对照管
样本
20
20
试剂一
60
80
试剂二
20
混匀，37℃孵育 30min 后，立即沸水浴或金属本试剂盒仅供科研使用
2
浴 5min 拿出。冷却至室温后再继续添加试剂。
试剂三
10
10
混匀，37℃孵育 15min。室温下于 12000rpm 离
心 10min，上清液待检测。
③ 在 96 孔板中依次加入：
试剂名称（
μL）
测定管
对照管
上步待测液
40
40
试剂四
10
10
试剂五
150
150
混匀，37℃避光孵育 20min，520nm 下读取吸光值
A，△A=A 测定-A 对照(每个样本做一个自身对照)。
【注】1.若 A 测定大于 1.5，可对③步的上清液用蒸馏水稀释，则稀释倍数 D 代入公式计算。
2.若△A 差值在零附近，可增加②步中样本的体积 V1（如增至 40μL，则试剂一相应减少），
则改变后的 V1 需代入公式重新计算。
五、结果计算：
1、标准曲线方程为 y =0.1166x - 0.007；x 为标准品质量（
μg），y 为△A。
2、按照蛋白浓度计算：
酶活定义：每毫克组织蛋白在每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
TPP(μg/h/mg prot)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷(V1×Cpr)÷T=2358.5×(ΔA+0.007) ÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
酶活定义：每克组织每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
TPP(μg/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷(W×V1÷V)÷T=2358.5×(ΔA+0.007)÷W
4、按细菌或真菌密度计算：
酶活定义：每 1 万个细菌或真菌每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
TPP(μg/h/104cell)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷(500×V1÷V)÷T=4.72×(ΔA+0.007)
5、按液体体积计算：
酶活定义：每毫升液体每小时催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
TPP(μg/h/mL)=[(ΔA+0.007)÷0.1166×(0.11÷0.04)]÷V1÷T=2358.5×(ΔA+0.007)
V--提取液体积，1 mL；V1--样本体积：0.02mL；W--样本质量，g；T--反应时间，0.5 小时；
500--细菌或真菌数量，500 万；0.11--第②歩反应的总体积；0.04--第③歩反应上清液体积；
Cpr--样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1 制备标准品母液（1mg/mL）：从标准品管中称量取出 2mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸馏水混匀
溶解即 1mg/mL 的葡萄糖（母液需在两天内用且-20℃保存）。
2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度：0, 0.04,0.08,0.12,0.16, 0.2mg/mL。
3 第③歩显色反应阶段检测：40μL 标准品+10μL 试剂四+150μL 试剂五，37℃避光孵育 20min，520nm
下读取吸光值 A。依据结果制作标准曲线。
文献和实验
技术资料