酸性木聚糖酶测试盒/酸性半纤维素酶测试盒（可见分光光度法）

酸性木聚糖酶（Acidic Xylanase，ACX）测定试剂盒说明书
分光光度法50管/24样

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物产生，能催化水解木聚糖，也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶，可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，因而广泛的应用于酿造和饲料工业中，ACX一般分离自耐酸的真菌，细菌及部分霉菌。

测定原理：
ACX在酸性环境下能将木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，进一步在沸水浴条件下与3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，在540nm处有特征吸收峰，反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在540nm吸光值增加速率，可计算ACX活力。

自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、恒温水浴锅，可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制：
缓冲液：液体90mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体12mL×1瓶，4℃避光保存。（若出现白色絮状或颗粒状沉淀，可60℃加热溶解后使用）。
试剂二：液体18mL×1瓶，4℃避光保存。

粗酶提取：

1. 发酵液：发酵液于8000g，4℃，离心15min，取上清，作为待测样品。
2. 酶干粉：称约0.1mg，加1mL缓冲液溶解待测。
3. 组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL缓冲液）进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心10min，取上清待测。

测定操作表：
 

	对照管	测定管
样品（μL）		200
灭活的样本（μL） （95℃水浴15min）	200
缓冲液（μL）	300	300
试剂一（μL）	200	200
混匀，50℃水浴中反应30min，立即沸水浴中10min灭活。(注意不要让盖子爆开，以免进水，改变了反应体系)
试剂二（μL）	300	300
混匀，沸水浴中显色5min(注意不要让盖子爆开，以免进水改变了反应体系)，1mL玻璃比色皿，540nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。

ACX计算公式：
标准曲线：y = 2.5554x - 0.002 ，R² = 0.9983
1. 按液体体积活力计算：
酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每毫升液体样本每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX活力（nmol/min/mL）= （ΔA+0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×10⁶
= 435× (ΔA+0.002)
2. 按蛋白浓度计算：
酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每毫克蛋白每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA +0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×10⁶÷Cpr
= 435×(ΔA +0.002 ) ÷Cpr
3. 按鲜重计算：
酶活定义：50℃，pH4.8条件下，每克样本每分钟分解木聚糖产生1nmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX活力（nmol/min/g鲜重）= （ΔA +0.002）÷2.5554÷150÷T×稀释倍数×10⁶÷W
= 435×(ΔA +0.002 ) ÷W

150：木糖的分子量；T：反应时间，30min；稀释倍数=V反总÷V样=1000µL÷200µL=5；
10⁶：转化因子，即1mg/mL=10⁶ng/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

注意事项：
1. 吸光度变化应该控制在0.01~0.8之间，否则加大样品量或稀释样品，注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。
2. 试剂盒2-8℃保存，保质期3个月，建议尽快使用