黄热病毒IgM抗体ELISA试剂盒 96T

储存和使用期：2-8°C

应用：用于定性检测人血清，血浆，细胞培养上清液或任何生物液体中的YFV-IgM。

介绍

黄热病，历史上称为黄色杰克，黄色瘟疫或青铜约翰，是一种急性病毒性疾病。在大多数情况下，症状包括发热，寒战，食欲不振，恶心，特别是在背部的肌肉痛，和头痛。症状通常在五天内改善。在一些人在一天内改善，发烧回来，腹痛发生，肝损伤开始导致黄色皮肤。如果发生这种情况，出血和肾脏问题的风险也增加。

测定原理

96孔板YFV-IgM特异性抗原。将对照或测试样品加入到合适的孔中并孵育。用洗涤缓冲液洗去游离组分。将HRP缀合的检测试剂加入到孔中。 TMB底物用于显现HRP酶反应。 TMB由HRP催化以产生在加入酸性停止溶液后变为黄色的蓝色产物。黄色的密度与板中捕获的样品的YFV-IgM量成比例。外径在微板读数器中在450nm下通过分光亮度计测量吸亮度，然后可以计算YFV-IgM的浓度。

套件组件

1.       一个96孔板预涂

2.       阳性对照：0.5ml

3.       阴性对照：0.5ml

4.       洗涤缓冲液（30×）：20 ml。稀释：1:30

5.       样品稀释缓冲液：6ml

6.       6HRP酶联试剂（RTU）：6ml

7.       终止液：6ml

8.       TMB底物：6ml

9.       TMB底物B：6ml

10.   板密封：2

11.   密封袋：1

需要材料但不提供

1.37℃培养箱

2.酶标仪（波长：450nm）

3.精确的移液器和一次性移液器吸头

4.自动洗板机

5.ELISA振荡器

1.5ml管

7.板盖

8.吸收滤纸

9.100ml和1L体积量筒。

 

 

使用程序:

A.制备样品和试剂

1. 样品

收集并立即分析测试样品（2小时内）后立即分离。或等分并长期储存在-20°C。避免多个冻融循环。

细胞培养上清：以约2000-3000×rpm离心20分钟，以去除沉淀，立即分析或分装，并储存于-20℃。

血清：在室温下凝结血清（约4小时）。以约2000-3000×rpm离心20分钟。立即分析血清或等分，并储存在-20°C。

血浆：用柠檬酸盐或EDTA作为抗凝剂收集血浆。在收集30分钟内以2000-3000×rpm离心20分钟。立即分析或等分，并存储在-20°C冷冻。

尿：在无菌容器中收集，以2000-3000×rpm离心20分钟。立即分析或等分，并存储在-20°C冷冻。

组织：组织匀浆的制备将根据组织类型而变化。收集和冲洗样品在2-4℃下用PBS（Ph 7.4）。称重样品并用PBS（Ph 7.4）匀化，并对细胞悬浮液进行超声处理。以2000-3000×rpm离心20分钟。立即测定或等分并储存在-80℃。

 

注意：

1.完全凝结血液样品，离心，避免溶血和沈淀。

2.NaN3不能用作试验样品防腐剂，因为它抑制HRP。

 

2.洗涤缓冲液

用蒸馏水稀释浓缩洗涤缓冲液30倍（1/30）（即将20ml浓缩洗涤缓冲液加入580ml蒸馏水中）。

 

B.测定程序

在使用前将试剂盒组分和样品平衡至室温。建议绘制每个测试的标准曲线。

1.在预涂板上分别设置阳性/阴性，测试样品和对照（零）孔，并记录它们的位置。

2.将50μl的阴性和阳性对照等分到设定的孔中。

3.向对照（零）孔中加入50μl样品稀释缓冲液。

4.向测试样品孔中加入50μl适当稀释的样品。在底部加入溶液而不接触侧壁。摇动平板以混合内容物。

5.用盖子密封板，并在37℃孵育30分钟。

6.取下盖子并通过在吸收性滤纸或其他吸收材料上敲击板来丢弃板内容物。

7.弃去溶液，用洗涤缓冲液洗涤板5次。不要让孔在任何时候完全干燥。

 

手动清洗：丢弃溶液，不要接触侧壁。将吸水滤纸或其他吸收材料上拍出液体。将洗涤缓冲液填满每个孔，并在ELISA振荡器上轻轻涡流2 分钟。丢弃内容物，并将吸收性滤纸或其他吸收材料上的板敲打。洗板五次。

自动洗涤：弃去所有孔中的溶液，并用洗涤缓冲液洗涤板5次（用缓冲液过量填满孔）。在最后的洗涤之后，翻转该板并敲击吸收性滤纸或其它吸收材料。建议将清洗器设置为1分钟的浸泡时间。

 

8.向每个孔中加入50μlHRP结合物的试剂（对照孔除外）。在每个孔底部加入溶液，不要接触侧壁。

9.用盖子密封板，并在37℃孵育30分钟。

10.取下盖子，用洗涤缓冲液洗板5次。

11.向每个孔中加入50μlTMB底物A和50μlTMB底物B，盖上平板并在37℃下孵育15分钟。避免暴露于光。

12.向每个孔中加入50μl终止液，充分混匀。颜色应立即变为黄色。

13.阅读O.D.在微板读数器中在450nm的吸亮度在加入终止溶液的15分钟内。对于计算，（相对O.D.450）=（每个孔的O.D.450） - （零阱的O.D.450）。标准曲线可以作为每种标准溶液（Y）的相对O.D.450与标准溶液（X）的相应浓度作图。可以从标准曲线插入样品的人类YFV-IgM浓度。

14.注意：如果稀释样品，稀释倍数乘以内插法得到稀释前的浓度。

 

C.结果确定

1.试验有效性：阳性对照的平均值≥1.00; 阴性对照的平均值≤0.10。

2.临界值（CUT OFF）计算：临界值=负控制的平均值+0.15

3.阴性结果：如果OD值

4.阳性结果：如果OD值≥CUTOFF，样品为人类YFV-IgM阳性。

 

D.注意事项

1.在实验之前，离心每个试剂盒组分数分钟，将所有试剂倒入试管底部。

2.在混合或重新组装部件时避免起泡或气泡。

3.洗涤缓冲液可结晶并分离。如果发生这种情况，请加热管以溶解。

4.建议每个对照和样品一式两份或重复测量三次。

5.不要让板在任何时候完全干燥！这可以使板上的生物材料失活。

6.不要重复使用移液器吸头和管，以避免交叉污染。

7.不要使用不同套件中过期的组件或组件。

8.将TMB底物B储存在黑暗中，并且为了避免板温育对于温度差的边缘效应，建议在使用前在室温下使TMB底物平衡30分钟。用灭菌的吸头抽吸所需的剂量，不要将残留溶液倒回到小瓶中。