本试剂盒仅供科研使用
总生物碱含量测定试剂盒说明书
(货号:WS5010W 微板法 96 样)
一、产品简介:
生物碱是存在于生物体内的含氮有机化合物,大多数存在于植物中,目前已分离到三千
余种,其中近百种具有很强的生理活性,广泛应用于临床医疗。
利用生物碱与溴甲*绿反应生成黄色物质,该物质在 415nm 有特征吸收峰,通过检测
415nm 的增加量即可得出样本中总生物碱含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
液体 3mL×1 瓶
4℃保存
临用前按照二氯*烷:甲醇:提取液(试
剂盒提供)以 40:10:1 的比例混匀,备用。
试剂一
A:粉体 mg×1 支
B:液体 1mL×1 支
4℃保存
试剂二
液体 9.4mL×1 瓶
4℃保存
标准品
粉体 mg×1 支
4℃保存
若重新做标曲,则用到该试剂。
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔 UV 板、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、二氯*烷、甲醇。
四、总生物碱含量的测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
样本经 60℃烘干,打碎过筛,取 0.05 g 过筛后样本至 2mLEP 管中,加入 1mL 提取液,
室温震荡提取 30 min,超声提取 30 min(间隔 3min 拿出震荡 1min 再继续超声);最终
用提取液补足至 1mL 液面位置,然后室温 4000rpm 离心 10min,取上清液测定。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 415nm。
② 临用前配置工作液:取 0.6mL 试剂一 B 液至 A 中,混匀完全溶解。再全部转移至试
剂二中,混匀备用。在 EP 管中依次加入:
试剂名称(μL)
测定管
空白管(仅做一次)
样本
40
二氯*烷
400
400
蒸馏水
200
200
工作液
80
80
上下震荡(手动)5min,室温(25℃)静置 30min,取下层 200μL
澄清液体至 96 孔 UV 板中,于 415nm 处快速读取吸光值 A,
△A=A 测定-A 空白。
【注】:1. 若△A 差值低于 0.01,可增加样本取样质量 W 或加大样本体积 V1(如增至 100μL,
则二氯*烷相应减少),则改变后的 W 和 V1 需代入计算公式重新计算。
2. 若 A 测定大于 1,可对样本上清用二氯*烷稀释,则稀释倍数 D 代入公式计算。本试剂盒仅供科研使用
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五、结果计算:
1、标准曲线方程:y = 0.0493x + 0.0035;x 为标准品质量(μg);y 为△A。
2、按照样本质量计算:
总生物碱含量(μg/g 重量)=[(△A-0.0035)÷0.0493]÷(W×V1÷V)×D
=507.1×(△A-0.0035)÷W×D
V---提取液的总体积,1mL;
V1---加入反应体系样本体积,0.04mL;
W---样品质量,g;
D---稀释倍数,未稀释即为 1。
附:标准曲线制作过程:
1 制备标准品母液(500μg/mL):向标准品 EP 管中加入 1mL 二氯*烷溶解。
2 把母液用二氯甲*稀释成以下浓度梯度的标准品:0,40,80,120,160,200μg/mL。
也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3 依据测定管的加样表操作,根据结果即可制作标准曲线。