β-Secretase 1 (BACE1)活性荧光检测试剂盒

碧云天研发的β-Secretase 1 (BACE1)活性荧光检测试剂盒(BACE1 Activity Fluorometric Assay Kit，或BACE1 Activity Assay Kit (Fluorometic))是一种用荧光法简单、快速、高通量、高灵敏地检测小鼠、大鼠、人等的组织或细胞样品中β-Secretase 1活性的试剂盒。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

β-Secretase 1 (β-分泌酶1)，也称为β位淀粉样前体蛋白裂解酶1、β位APP裂解酶1 (Beta-site APP cleaving enzyme 1, 简称BACE1)、膜相关天冬氨酸蛋白酶2 (Membrane-associated aspartic protease 2)、Memapsin-2、天冬氨酰蛋白酶2 (Aspartyl protease 2, 简称ASP2)。BACE1是一种天冬氨酸蛋白酶，可以切割淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)产生40或42个氨基酸的β-淀粉样蛋白肽(Amyloid-β peptide)。阿尔茨海默氏症(Alzheimer's disease)，俗称早老性痴呆、老年痴呆，是一种发病进程缓慢、随着时间不断恶化的神经退化性疾病，会导致脑萎缩和脑细胞死亡。阿尔茨海默氏症患者大脑中β-淀粉样蛋白肽在斑块和血管壁的沉积被普遍认为是导致该疾病的主要因素[1]。实验表明抑制BACE1活性可以有效减少β-淀粉样蛋白肽的产生，因此检测BACE1活性对预测和治疗阿尔茨海默病具有重要意义[2-5]。

β-Secretase 1 (BACE1)活性荧光检测试剂盒采用荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法，其检测原理如下。MCA是荧光供体(Donor)，Dnp是荧光受体(Acceptor)或称为淬灭基团(Quencher)，这两个荧光基团的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般7-10nm)，荧光能量由供体向受体转移，导致供体荧光分子自身的荧光强度衰减。MCA和Dnp被连接到BACE1蛋白酶的底物(Substrate)的两端。当BACE1没有切割底物时，两个基团足够接近，发生荧光共振能量转移，即Dnp可淬灭MCA的荧光而导致检测不到荧光；当该底物被BACE1切割后，多肽的首尾两端分离，两个基团分开，MCA的荧光不再被Dnp淬灭，即可检测到MCA的荧光，这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测BACE1蛋白酶的酶活性。如果在反应体系中加入BACE1的抑制剂(Inhibitor)，荧光的生成会被抑制，荧光强度与抑制剂的抑制效果成反比，这样就可以检测出BACE1蛋白酶抑制剂的抑制效果。MCA的最大激发波长为325nm，最大发射波长为393nm。

图1.碧云天β-Secretase 1 (BACE1)活性荧光检测试剂盒(P0362)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽。本试剂盒提供的底物(BACE1 Substrate)为MCA-EIDLMVLDK(Dnp)，BACE1酶剪切该底物的速率比常见的Swedish variant多肽(EVNLDAEF)快约13倍[6]，因此该底物更适合用于BACE1抑制剂的筛选。本试剂盒提供的标准品(MCA Standard)在0.25-2.5nmol范围内有良好的线性关系(图2A)。用户可以通过设置标准曲线，计算出样品中BACE1的活性。同时，本试剂盒还提供了BACE1酶阳性对照(Positive Control) (图2B)，便于检测体系的建立。

图2.碧云天β-Secretase 1 (BACE1)活性荧光检测试剂盒(P0362)用于MCA标准曲线、BACE1阳性对照及组织样品的检测效果图。A. 本试剂盒的MCA标准曲线示意图。B. 不同量的BACE1酶阳性对照(Positive Control)酶切底物，生成产物的荧光强度示意图。C. 小鼠脑组织的BACE1酶活性检测效果。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒使用灵活，检测速度快，样品用量少。本试剂盒采用一步法检测，简单快速，全程约0.5-1小时即可完成。96孔板中通常1-10μl样品足够用于BACE1酶活性的检测。

本试剂盒中提供的Lysis Buffer通用性强，可直接用于裂解细胞或组织样品用于检测BACE1酶活性。

用于96孔板检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测，中包装可以进行500次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
P0362S-1	Lysis Buffer	25ml
P0362S-2	Protein Concentration Buffer	50ml
P0362S-3	Assay Buffer	40ml
P0362S-4	BACE1 Substrate (10X)	500μl
P0362S-5	Positive Control	100μl
P0362S-6	MCA Standard (10mM)	10μl
－	说明书	1份

 

产品编号	产品名称	包装
P0362M-1	Lysis Buffer	125ml
P0362M-2	Protein Concentration Buffer	250ml
P0362M-3	Assay Buffer	200ml
P0362M-4	BACE1 Substrate (10X)	2.5ml
P0362M-5	Positive Control	500μl
P0362M-6	MCA Standard (10mM)	50μl
－	说明书	1份

保存条件：

-20℃保存，一年有效。其中MCA Standard (10mM)和BACE1 Substrate (10X)需避光保存。Positive Control在-80℃保存更佳。

注意事项：

Protein Concentration Buffer、Assay Buffer、BACE1 Substrate、MCA Standard需完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。Positive Control在使用时应置于冰上。使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。

如果使用本试剂盒提供的Lysis Buffer制备样品，并且加入的样品量在本试剂盒的推荐范围内，可以确保反应体系的pH值在适宜的范围内。如果使用自行配制的裂解液，请确保加入样品后反应体系的pH值在6.2-6.8之间，或者确保样品的pH值在6.2-6.8之间，否则可能会影响检测结果的信号值和稳定性。

如果Protein Concentration Buffer中有沉淀，20-30℃水浴加热可以溶解沉淀；如果加热后沉淀仍旧存在，静置或离心后使用上清液。

虽然本试剂盒中的BACE1 Substrate有很高的特异性，但仍然有可能有一些蛋白酶可以切割本底物，建议进一步使用BACE1特异性抑制剂Verubecestat (MK-8931) (SF1183)进行验证。

检测时建议使用96孔黑板，推荐选购碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)。

用于BACE1活性检测时，细胞、组织等裂解样品如果置于4℃保存，保存的时间不应超过1天，否则会影响检测结果的准确性，通常细胞、组织等裂解样品宜在-20℃保存，-80℃保存更佳。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。