幼虫芽胞杆菌（美洲蜂幼虫腐臭病）探针法荧光定量PCR试剂盒

幼虫芽胞杆菌（美洲蜂幼虫腐臭病）探针法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Bacillus larvae
幼虫芽孢杆菌（Bacillus larvae）是引起美洲蜂幼虫腐臭病（American foul brood）的病原。美洲蜂幼虫腐臭病又名烂子病，是蜜蜂幼虫和蛹的一种 细菌性、急性、毁灭性病害。特征为病蜂的蜂盖子脾下陷、穿孔、封盖幼虫死 亡、蛹虫现象等。美洲蜂幼虫腐臭病最初发生于英国，以后传到欧美各国，截 止至 2011 年全世界均有发生。美洲蜂幼虫腐臭病不但危害性大，而且一旦发 生就很难根除。轻者影响蜂群繁殖和采集力，重者造成蜂群的覆灭，因此幼虫 芽孢杆菌快速检测具有重要的意义。本试剂盒根据 PCR 原理开发。

产品特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。 
2. 根据幼虫芽胞杆菌保守区域设计引物和探针，能专一性地检测出样品中 的幼虫芽胞杆菌。 
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。 
4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。 
5. 本只能用于科研，足够 50 次 20μL 体系的荧光定量 PCR。

幼虫芽胞杆菌（美洲蜂幼虫腐臭病）探针法荧光定量PCR试剂盒包装规格及成分：

编号	成分	规格
试剂一	2×Probe qPCR MagicMix	500 μL（本色盖）
试剂二	荧光 PCR 专用模板稀释液	1 mL（黄盖）
试剂三	幼虫芽胞杆菌探针法 qPCR 引物 混合液	100 μL（白盖）
试剂四	幼虫芽胞杆菌 qPCR 探针	50 μL（棕色管）
试剂五	幼虫芽胞杆菌探针法 qPCR 阳性 对照(1×10E8 拷贝/μL)	50 μL（黄盖）
试剂六	使用手册	1 份

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂：DNA 模板


 

使用方法：

一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头， 下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼 容。
三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用 水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加）：

成分	N+2 个 样品管	PCR 阴性 对照	PCR 阳性 对照
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
幼虫芽胞杆菌qPCR 探针	1 μL	1 μL	各1 μL
幼虫芽胞杆菌探针法 qPCR 引物 混合液	2 μL	2 μL	各2 μL
N+2 个待测 DNA 模板	7 μL
超纯水		7 μL
第 7 步所得标准曲线样品稀释液 （2-7 号）			各7 μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	5 min
PCR 反应 （40 个循环）	95℃	15sec
	60℃	1 min（采集 FAM 通道的荧 光信号）

四、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值 为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。



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