羧酸酯酶（CarE）活性测定试剂盒

羧酸酯酶（CarE）活性测定试剂盒说明书
                                               微量法 100T/96S


注   意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
哺乳动物CarE，也称脂族酯酶（aliesterase），广泛分布于组织和器官，属于丝氨酸水解酶家族。CarE催化含酯键、酰胺键和硫酯键的内源性与外源性物质水解，但不能催化水解乙酰胆碱及其类似物。CarE参与脂质运输和代谢，并且与多种药物、环境毒物以及致癌物的解毒和代谢有关，有机磷农药可结合并且抑制CarE活性。

测定原理：
CarE能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固篮显色；在450 nm光吸收增加速率，计算CarE活性。

自备仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配置：
试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体15mL×2瓶， 4℃保存；
试剂三：粉剂×2支， 4℃保存，临用前取1支试剂三，加0.6ml无水乙醇充分溶解；
试剂四：粉剂×2支，-20℃保存，临用前取1支试剂四，加少量试剂二溶解；
工作液配制：临用前配制，向1瓶试剂二中，加入溶解后的试剂三和试剂四各1支，充分溶解，过滤，4℃避光保存，可用1周。

粗酶液提取：
细菌、细胞样品制备
收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL试剂一，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000g 4℃离心30min，取上清液待测。
2、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆；12000g 4℃离心30min，取上清液待测。
3、液体：直接测定

测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到450 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二置于37℃水浴中预热30 min。
3. 空白管：取微量玻璃比色皿/96孔板，依次加入5μL蒸馏水和200μL试剂二，迅速混匀，于450nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。△A空白管=A2-A1
4. 测定管：取微量玻璃比色皿/96孔板，依次加入5μL上清液和200μL试剂二，迅速混匀，于450nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A3，第190s吸光值记为A4。△A测定管=A4-A3

注意：空白管只需测定一次。

CarE活性计算公式：

1. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1 组织中CarE活性

1. 按蛋白浓度计算

CarE活性单位定义：每mg组织蛋白在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为1个酶活单位。

CarE酶活(U/mg prot)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总÷(Cpr×V样)÷T
= 13.67×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr

2. 按样本鲜重计算

CarE活性单位定义：每g组织在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为1个酶活单位。
CarE酶活(U/g 鲜重)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总×（V样总÷V样）÷W÷T
=13.67×(△A测定管-△A空白管)÷W
2 细菌或细胞中CarE活性
CarE活性单位定义：每1万个细菌或细胞在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为一个CarE活性单位。
CarE酶活(U/10⁴ cell)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总×（V样总÷V样）÷细胞密度（10⁴ cell/mL）÷T=13.67×(△A测定管-△A空白管)÷细胞密度（10⁴ cell/mL）
3. 液体中CarE活性
CarE活性单位定义：每毫升样品在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为1个酶活单位。
CarE酶活(U/mL )= (△A测定管-△A空白管) ×V反总÷V样÷T
=13.67×(△A测定管-△A空白管)
V反总：反应体系总体积，205μL=2.05×10^-4L；V样总：上清液总体积，1 mL；V样：加入上清液体积(mL)，0.005 mL；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量（g）；T：反应时间（min），3min。
 

2. 使用96孔板测定的计算公式如下

1 组织中CarE活性

3. 按蛋白浓度计算

CarE活性单位定义：每mg组织蛋白在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为1个酶活单位。

CarE酶活(U/mg prot)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总÷(Cpr×V样)÷T
= 13.67×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr

4. 按样本鲜重计算

CarE活性单位定义：每g组织在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为1个酶活单位。
CarE酶活(U/g 鲜重)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总×（V样总÷V样）÷W÷T
=13.67×(△A测定管-△A空白管)÷W
2 细菌或细胞中CarE活性

CarE活性单位定义：每1万个细菌或细胞在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为一个CarE活性单位。
CarE酶活(U/10⁴ cell)= (△A测定管-△A空白管) ×V反总×（V样总÷V样）÷细胞密度（10⁴ cell/mL）÷T=13.67×(△A测定管-△A空白管)÷细胞密度（10⁴ cell/mL）
3. 液体中CarE活性
CarE活性单位定义：每毫升样品在37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加1定义为1个酶活单位。
CarE酶活(U/mL )= (△A测定管-△A空白管) ×V反总÷V样÷T
=13.67×(△A测定管-△A空白管)
V反总：反应体系总体积，205μL=2.05×10^-4L；V样总：上清液总体积，1 mL；V样：加入上清液体积(mL)，0.005 mL；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量（g）；T：反应时间（min），3min。