丙/酮酸（pyruvic acid PA）含量测定试剂盒

丙/酮酸（pyruvic acid PA）含量测定试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

注   意 ： 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
丙/酮酸通过乙酰CoA 连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢，起着重要的枢纽作用。

测定原理：
丙/酮酸与2,4-二硝基/苯/肼作用，生成丙/酮酸-2,4-二硝基/苯腙，在碱性溶液中呈显色。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、
蒸馏水。

试剂的组成和配制：
提取液：液体100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体2.5mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂二：液体12.5mL×1 瓶， 4℃保存。

丙/酮酸提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细菌或细胞加入1mL 提 取液），超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次），静置30min， 8000g，25℃离心10min，取上清待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，
加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆，静置30min，8000g，25℃离心10min，取上清待测。
3、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建
议取0.1mL 血清（浆）加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆，静置30min， 8000g，25℃离心
10min，取上清待测。

测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。
2、在微量石英比色皿或96 孔板中加入75μL 样本和25μL 试剂一，混匀，静置2min，加入
125μL 试剂二，混匀，于520nm 波长处测定管吸光值A。

丙/酮酸含量计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0466x + 0.0675； x 为丙/酮酸含量（µg/mL），y 为吸光值。
2、按照血清（浆）体积计算

丙/酮酸含量（μg/mL）= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（V3×V1÷V2）=214.6×(A-0.0675)
3、按照蛋白浓度计算
丙/酮酸含量（μg/mg prot）=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)=21.46×(A-0.0675) ÷Cpr
4、按照样品质量计算
丙/酮酸含量（µg/g 鲜重）= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W ×V1÷V2）=21.46×(A-0.0675) ÷W
3、按照细菌或细胞密度计算
丙/酮酸含量（μg/104 cell）＝[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（500×V1÷V2）=0.043×(A-0.0675)
V1：加入反应体系中样本体积，0.075mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆）
体积，0.1 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，
500 万。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、标准条件下测定回归方程为y = 0.0233x + 0.0675； x 为丙/酮酸含量（µg/mL），y 为吸光
值。
2、按照血清（浆）体积计算
丙/酮酸含量（μg/mL）= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷（V3×V1÷V2）=429.2×(A-0.0675)
3、按照蛋白浓度计算
丙/酮酸含量（μg/mg prot）=[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(V1×Cpr)=42.92×(A-0.0675) ÷Cpr
4、按照样品质量计算
丙/酮酸含量（µg/g 鲜重）= [(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷(W ×V1÷V2）=42.92×(A-0.0675) ÷W
3、按照细菌或细胞密度计算
丙/酮酸含量（μg/104 cell）＝[(A-0.0675)÷0.0233×V1]÷（500×V1÷V2）=0.086×(A-0.0675)
V1：加入反应体系中样本体积，0.075mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆）
体积，0.1 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，
500 万。

注意：
最低检测限为 1μg/mL 或 1μg/g 鲜重或 10ng/mg prot