乳酸含量（lactic acid，LA）试剂盒

乳酸含量（lactic acid，LA）试剂盒说明书
   微量法100T/48S

注   意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物，与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。

测定原理：
乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙/酮酸，同时使NAD⁺还原生成NADH和H⁺，H⁺传递给PMS生成的PMSH₂还原INT生成红色物质，在530nm处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：
天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制：
提取液：液体110mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体2mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1支，-20℃避光保存。临用前加入0.6mL蒸馏水充分溶解。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加6mL蒸馏水充分溶解。
试剂五：粉剂×1支，4℃避光保存。
标准品：液体1mL×1支，4℃保存。
显色液：临用前根据用量按照提取液（V）：试剂三（V）：试剂四（V）：试剂五（m）=1（mL)：0.3（mL)：3（mL)：15（mg）的比例充分混匀。（注意：现配现用，用多少配多少，在棕色瓶中配制，试剂盒中带有4个棕色空瓶）

样本处理：

1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，12000g离心10min，取上清测定。
2. 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，12000g离心10min，取上清测定。
3. 血清：直接测定。             

测定操作：
 

	样品对照管	样品测定管	标准对照管	标准测定管
样品（μL）	10	10
标准品（μL）			10	10
H2O（μL）	60	90	60	90
试剂一（μL）	30		30
试剂二（μL）	40	40	40	40
显色液（μL）	60	60	60	60
充分混匀，于37℃反应30min，于微量石英比色皿/96孔板，测定530nm处吸光值，分别记为A1，A2，A3，A4，△A样=A2-A1；△A标= A4-A3

注意：标准对照管和标准测定管只需测定一次，每个样品测定管设一个样品对照管


计算公式：
1. 按照蛋白含量计算
LA含量（μmol/mg prot）= △A样÷△A标×C标÷ Cpr
                      = 2×△A样÷△A标÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
LA含量（μmol/g 鲜重）= △A样÷△A标×C标÷ W
                      = 2×△A样÷△A标÷ W

3. 按照细胞数量计算

LA含量（μmol/10⁴ cell）= △A样÷△A标×C标÷ 细胞数量
                      = 2×△A样÷△A标÷ 细胞数量
4. 按照液体体积计算
LA含量（μmol/mL）= △A样÷△A标×C标
                   = 2×△A样÷△A标
C标：标准品浓度，2mmol/L；W：样本质量，g/mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL

注意事项：

1. 若吸光值超过2，请进行适当的稀释后再进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
2. 最低检出限为1.8μmol/L。