一.细胞介绍
1970年G. Trempe 和 L.J. Old从胸水中建立了这株细胞。没有病毒颗粒。超微结构特征包括微丝和桥粒,肝糖原颗粒,大溶酶体,成束的细胞质纤丝。SK-BR-3细胞株过表达HER2/c-erb-2基因产物,该细胞通过慢病毒转染的方式携带Luc基因。
二.细胞特性
(1)来源:器官:乳腺;乳房 疾病
(2)形态:上皮细胞样,贴壁生长
(3)含量:>1x10⁶cells
(4)规格:T25瓶或者1mL冻存管包装
(5)用途:仅供科研使用。
三.培养基及培养冻存条件
完全培养基 |
McCOY's 5A( 含NaHCO3 2.2g/L)或DMEM(含NaHCO3 1.5g/L;)培养基;优质胎牛血清,10%;双抗,1%。 |
培养条件 |
气相:空气,95%;二氧化碳,5%。 温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80% |
冻存液 |
90%血清 + 10%DMSO,现用现配 |
注意: 该细胞在DMEM(含1.5g/LNaHCO3)培养基中生长良好,大部分品牌的DMEM含有较高浓度的NaHCO3(3.7g/L),若使用DMEM(3.7g/L NaHCO3)培养基培养细胞时需要提高CO2浓度(7%-10%)。复苏初期细胞贴壁不牢,会有悬浮细胞出现,在传代和换液时注意回收(1000rpm 5min)悬浮的细胞。细胞生长融合到80%以后会有悬浮细胞出现。
细胞运输、保存及注意事项
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复苏细胞 |
冻存细胞 |
包装 |
充液的T25细胞培养瓶 |
1mL冻存管 |
运输条件 |
常温 |
干冰 |
保存方式 |
75%酒精消毒瓶壁,置于37℃恒温细胞培养箱 |
-80℃冰箱中保存过夜后转入液氮/立即复苏 |
注意事项 |
① 收到细胞后,75%酒精消毒瓶壁,将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h,若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染,请拍照后及时联系我们; ② 请在4或5X显微镜下确认细胞状态,同时给刚收到的细胞拍照,10X和20X各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存,作为售后时收到时细胞状态的依据; ③ 贴壁细胞:细胞在37℃培养箱中放置2-3h,显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况,有些贴壁细胞在运输过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下,可去除培养瓶中灌液培养基(若有未贴壁的细胞需要离心回收,重悬打入到原培养瓶中),加入新配制的完全培养基6-8mL,放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上,可以对细胞进行传代处理。传代过程中,若因运输振动脱落的细胞需要离心回收; ④ 运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞,请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1:2传代。 |
细胞筛选:
该细胞为稳定转染Luc的细胞,随细胞传代次数的增加,其Luc荧光强度会逐渐减弱。若实验要求需要维持荧光强度,可以加入嘌呤霉素进行再次筛选,建议收到细胞后至少传3代,冻存留种后再进行筛选。初次进行细胞筛选时,建议加入终浓度为1ug/ml嘌呤霉素的完全培养基维持培养,若无细胞漂浮或者漂浮较少,即可更换为含2ug/ml嘌呤霉素的完全培养基继续筛选,以此类推,至最高药物浓度为5ug/ml。若筛选过程中,漂浮细胞大于60%,则停止筛选,换成正常培养基培养,至细胞密度约80%,可继续加入同浓度嘌呤霉素进行筛选。当加入5ug/ml嘌呤霉素时细胞正常增殖,可停止筛选,用不含药完全培养基正常培养。
细胞复苏、传代、冻存操作
(一)冻存细胞的复苏
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入到含4~6mL完全培养基的离心管中混合均匀,1000rpm/min离心3~5min,弃去上清液。加入1mL完全培养基重悬细胞后,均匀铺于含6~8mL完全培养基的培养瓶(或皿)中,置于37℃恒温细胞培养箱中过夜培养。第二天显微镜下观察细胞生长情况。
注意:建议复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩,避免冻存管处于温差较大情况下发生爆炸造成人员伤害。
(二)细胞传代(建议以同等底面积的培养瓶/皿按照1:2比例传代)
① 待细胞密度达到80%~90%时,即可进行传代培养。
② 弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次,吸净残余的PBS。
③ 加入0.25%(w / v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL),置于37℃培养箱中消化1-2分钟(难消化的细胞可以适当延长消化时间),显微镜下观察细胞大部分变圆并脱落,即可轻拍培养瓶至细胞全部脱落。迅速拿回操作台,加入2倍体积的、含10%FBS的培养基终止消化。
④ 将细胞悬液移入离心管中,1000rpm/min离心3-5min,弃去上清液。
⑤ 向细胞沉淀中加入1~2mL完全培养基重悬细胞,轻吹混匀。将细胞悬液按1:1比例均匀铺于2个新的培养瓶/皿中,添加6~8mL完全培养基,置于37℃恒温细胞培养箱中培养。后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
(三)细胞冻存
① 细胞冻存时,步骤同细胞传代的①~④,细胞计数后,加入配制好的细胞冻存液,重悬细胞,按照1×106 ~ 1×107个细胞/mL分配到一个冻存管中,标注好名称、代数、日期等信息。
② 将要冻存的细胞置于程序降温盒中,-80℃冰箱中过夜,之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。
注意事项:
所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性,必须在二级生物安全台内操作,并请注意防护,所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。
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