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常温
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90天
- 英文名：
pAAV-EnCMV-MCS-U6-shRNA
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50
- 供应商：
科淼生物
- 规格：
0.5ug/0.5ug
| 规格： | 0.5ug | 产品价格： | ￥680.0 |
|---|---|---|---|
| 规格： | 0.5ug | 产品价格： | ￥1380.0 |
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科淼生物拥有数万种质粒，还提供基因合成、质粒改造、载体构建和蛋白表达等精品实验服务，详情请联系客服！！！
1.载体（Vector）的概念
这种运载工具就叫做载体（vector）。
基因工程上所用的载体是一类能自我复制的 DNA 分子，其中的一段 DNA 被切除而不影响其复制，可用以置换或插入
外源(目的) DNA 而将目的 DNA 带入宿主细胞。常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等。
载体的功能及特征：
运送外源基因高效转入受体细胞
为外源基因提供复制能力或整合能力
为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体应具备的条件：
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点
具有较高的外源 DNA 的载装能力
具有多具有合适的筛选标记
种单一的核酸内切酶识别切割位点
2.质粒（Plasmid）的概念
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真
菌中，绝大多数的质粒是 DNA 型的，少部分为 RNA 型。天然 DNA 质粒大都具有共价、封闭、环状的分子结构，其分
子量范围：1-300 kb。细菌质粒是基因工程中最常用的载体。
质粒的基本特征：
质粒的自主复制性：质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统进行自主复制，其 DNA 上的复制子结构决定了质粒与寄主
的对应关系，并根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：
严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝
松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝
质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容
性，不相容性的质粒组成不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容。
pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容。
p15A 及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容。
质粒的可转移性：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
接合型质粒——能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如 F、Col、R 质粒等。
非接合型质粒——不能在天然条件下独立地发生接合作用如 Col、R 的其它成员。
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生 DNA 转移，这个过程由 bom 和
mob 基因决定
携带特殊的遗传标记：野生型的质粒 DNA 上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需
的附加性状，包括：
物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物等。
物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱等。
这些标记基因对 DNA 重组分子的筛选具有重要意义
3.质粒载体的分类
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。
质粒载体按功能分：
克隆载体—都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增 DNA 片段（基因）的载体。
表达载体—具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）还具有转录/翻译所必需的 DNA 顺序的载体。
质粒载体按进入受体细胞类型分：
原核载体
真核载体
穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）。穿梭质粒含原核和真核生物 2 个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。
科淼生物的各种产品发货前经经过严格的多重验证，收到质粒后请短暂离心，加入20ul ddH2O溶解质粒，取2ul转化至对应感受态中，挑取单克隆重新提取质粒后使用，需要质粒图谱或测序 报告可联系客服获取！！！
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文献和实验AAV 三保一是什么？shRNA 体内敲低一次保一条有效靶点
靶点对比 设计要点 做法 为什么 多靶点并行 单基因设计 3 条独立 shRNA 覆盖单靶点的随机失效 区域分散 分别靶向 CDS / 3'UTR 等不同区段 避免 mRNA 折叠致全部失效 GC 适中 推荐 35%–55% 范围 平衡稳定性与特异性、优化加工 脱靶低 避开基因组同源区域 保证干扰特异性 载体适配 U6 Pol Ⅲ 驱动，经典 GV478 载体（U6-MCS-CAG-EGFP） 高效转录、被 Dicer 加工 判定标准 RT-qPCR ΔCt
该载体在大肠杆菌中的复制。 U6启动子是确保目的shRNA转录，个人觉得转染的shRNA表达载体应该具有真核复制起点吧？！ 网上搜到一种RNAi载体pGO包含的序列：pUC复制起点pUCori、fl复制起点flori、细菌启动子P、卡那霉素基因Kan、HSV-TKPolyA、U6启动子U6promoter 和多克隆位点MCS，其特征在于还含有用于表达绿色荧光蛋白基因的转录元件，包括CMV启动子CMVpromoter、增强绿色荧光蛋白基因EGFP和 SV40PolyA
基因功能研究实验设计流程怎么走？从目的基因到验证的全链路拆解
（CRISPR）适合要彻底否定该基因功能、或者做稳转细胞株。顺带一句，干扰和敲除都建议配回复实验（rescue）：把靶点处做同义突变后再过表达，如果表型回来了，才坐实是靶点有效；或者干脆用两个独立有效靶点同时做，两个都出同一表型，基本能排除脱靶。 步骤 3 的载体与元件选择 载体不是随便选个空的就填基因。启动子决定了在哪表达：U6 是 III 型启动子，只驱动 shRNA 这种小 RNA，不能驱动蛋白编码基因；CMV/CAG 是广谱的 Pol II 启动子，适合过表达；hSyn、CaMKIIα、GFAP
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