【4D-蛋白组学】4D-DIA/DIA相对定量蛋白质组

       DIA（data-independent   acquisition），即数据非依赖采集技术，是近年来发展起来的一种新的质谱技术，隶属于非标记蛋白组学范畴。传统的质谱检测技术都是使用数据依赖采集模式（data-dependent  acquisition，DDA）来采集蛋白质谱数据，该模式需要从一级肽段中选择特定数量的肽段分子进行下游检测分析，而DIA通过在时间梯度上设置一定范围的质荷比窗口，对窗口下所有的肽段分子进行检测。该模式不涉及对肽段的限制性筛选，因此具有更好的定量准确性、覆盖度和重现性，适用于大规模样本的高度覆盖、稳定和可追溯地分析。
       利用新一代timsTOF Pro质谱仪开展的4D-DIA，可以更灵敏、更稳定地进行大队列样本检测，并实现检测各种不同基质中的蛋白质。

实验流程：
       本项目分析流程主要包括 DDA 建库与 DIA 分析两个阶段。 建立质谱实验分析流程主要包括蛋白质提取、肽段酶解、色谱分级、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）DDA数据采集、数据库检索等步骤；正式实验阶段主要包括DIA数据采集、special library检索、质控分析、定性定量结果分析及生物信息学分析，见下图。  

技术特点
1、更快的速度，大于 120 Hz MS/MS，是实际样本分析扫描速度最快的质谱仪之一；
2、更高的灵敏度，利用离子淌度在时间和空间进行聚焦，使灵敏度提高了 20 倍，对微量样品适应性好；
3、更高的专属性，与传统 3D 质谱相比增加了离子淌度这一维度，可对待测蛋白进行四维鉴定和定量分析；
4、更高的峰容量，通过离子淌度维度的加入使峰容量增加了 10 倍，能鉴定到更多的蛋白组；
5、在任何速度下均能保持高分辨率;
6、性能稳定，耐脏，重现性好，为临床大队列研究提供保障。


样品要求
细胞：5×10⁶个细胞；动物组织：50mg；植物组织：100mg；微生物：200mg；血清血浆：50μl

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一个细胞或组织中整个基因组表达的全部蛋白质就是蛋白质组的研究内容。蛋白质组学研究，即在高通量水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此从蛋白质水平上解析疾病发生的分子机制，获得细胞代谢等过程的全面认识。



Pubmed收录“proteomics”文献统计
   2020年12月，Nature Methods上发表了《diaPASEF: parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition》一文，标志着蛋白质组学研究正式进入了4D时代。文章中提到的timsTOF Pro 4D质谱技术通过分析分子量和离子淌度的相关性，搭配新的DIA数据采集模式，不仅覆盖了选择窗口中整个质核比范围，还提高了识别入射离子的分辨率，从而鉴定到更多的蛋白质种类，让蛋白质组学研究迈入了崭新的时代。

技术原理：
     利用质谱仪开展的蛋白组学研究中，质谱的扫描速度会影响蛋白的鉴定深度。引入双TIMS/PASEF® (Parallel Accumulation - SErial Fragmentation平行累积串行碎裂)分离技术的timsTOF Pro平台使得蛋白质组学进入了4D蛋白质组学新时代。传统的3D分离技术包括保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity），4D分离技术增加了第四个维度--离子淌度（mobility），进而大幅度的提高了扫描速度和检测灵敏度，大幅提升蛋白鉴定的数量和覆盖率。timsTOF Pro创新性地使用了双TIMS分离/富集装置，离子在第一个TIMS部分中进行累积，在第二个TIMS中根据淌度进行分离，经过分离后的离子继续用于MS/MS碎裂。往复进行此过程，当第二个TIMS进行分离时，第一个TIMS也同时在平行地累积离子，这样可以实现近乎100％的离子利用率，并减少1价离子（杂离子）的干扰。


实验流程：


技术特点：
· 更快的速度，大于 120 Hz MS/MS，是实际样本分析扫描速度最快的质谱仪。
· 更高的灵敏度，利用离子淌度在时间和空间进行聚焦，使灵敏度提高了20倍，对微量样品适应性好。
· 更高的专属性，与传统3D质谱相比增加了离子淌度这一维度，可对待测蛋白进行四维鉴定和定量分析，提高谱图可靠性。
· 更高的峰容量，通过离子淌度维度的加入使峰容量增加了10倍，能鉴定到更多的蛋白组。
· 在任何速度下均能保持高分辨率。
· 性能稳定，耐脏，重现性好。
· 实时数据库检索引擎（PaSER）的应用让数据采集和检索同步进行，节省数据分析时间。

产品分类：
    4D-labelfree,不需要对样品进行任何标记，每个样品可单独上机。利用DDA采集模式分析直接酶解后的蛋白肽段，获得蛋白质表达量变化情况，对蛋白进行定性定量分析。
    4D-labelfree修饰蛋白检测，富集修饰蛋白进行鉴定及定量研究，可分析蛋白磷酸化、乙酰化等各种修饰组学，获得修饰程度信息。
    4D-DIA，与Labelfree同属于非标记蛋白组学技术，但使用DIA采集模式替代DDA采集模式，不涉及对肽段的限制性筛选，因此具有更好的定量准确性，适用于复杂体系、海量样品的差异检测。
    4D-Super Blood dDIA，通过生物磁珠去除高峰度蛋白，突破物种和蛋白种类的限制，同时通过分析分子量和离子淌度的相关性，并搭配新的DIA数据采集模式，从而鉴定到更多的蛋白质种类，为血液蛋白质组学的研究提供了完美的解决方案。
    4D-Trace Sample dDIA，通过分析分子量和离子淌度的相关性，搭配刚新的DIA数据采集模式，从而可以鉴定到更多的蛋白质种类，更加具有微量样本检测优势，为科研用户对极难获得的珍贵样本的研究提供了保证。
    4D-外泌体蛋白组，通过增加第四个维度--离子淌度（mobility）结合TIMS/PASEF® (Parallel Accumulation - Serial Fragmentation平行累积串行碎裂)分离技术，并搭配新的DIA数据采集模式，大幅度地提高了扫描速度以及蛋白鉴定的数量和覆盖率，为外泌体样本研究提供了保证。
    4D-PRM，是可对目标蛋白质（或肽段）进行绝对定量分析的靶向蛋白质组学技术，用于验证大规模蛋白质组学几十个到上百个蛋白质的定量结果，通量高，灵敏度好。

应用场景：
    微量样品，离子淌度的应用带来了更高的灵敏度和专属性，极大的提高了微量样品（如FFPE、穿刺样品等）的蛋白检出数和准确性。
    大队列样品研究，极快的扫描速度、耐脏和高稳定性是大队列样品蛋白质组学研究的保障。
    修饰组学，离子淌度能更好的区分同分异构体，可更有效地区分具有相同质荷比但修饰位点不同的修饰蛋白质。

测试结果：

研究思路：


应用案例：非小细胞肺癌的蛋白质基因组学揭示了与特定治疗靶点和免疫逃避机制相关的分子亚型

影响因子：23.177；发表时间：2021.11；发表期刊：Nature cancer

研究者对141例非小细胞肺癌(NSCLC)的所有主要组织学进行了深入的基于质谱（TMT）的蛋白质基因组分析。他们确定了6种不同的蛋白质组亚型，并发现在免疫细胞组成和免疫检查点的亚型特异性表达方面存在显著差异。出乎意料的是，在免疫冷亚型中，高新抗原负担与全局低甲基化和复杂的新抗原定位到基因组区域(如内源性逆转录病毒元素和内含子)有关。此外，他们通过STK11突变依赖的HNF1A激活和FGL1表达将免疫逃避与LAG-3联系起来。最后，他们开发了一种独立数据采集质谱的NSCLC亚型分类方法，在208例NSCLC病例的独立队列中验证了该方法，并通过分析84例晚期NSCLC活检标本证明了其临床应用价值。

实验设计（a，b）和蛋白聚类结果（c）


抑制性受体及其配体的蛋白水平