TUNEL细胞凋亡检测服务

　　TUNEL细胞凋亡检测服务实验原理和方法原理：细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30%的染色体DNA在Ca2和Mg？依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180~200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的37-0H末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的37-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有37-OH形成，很少能够被染色。

　　

        细胞凋亡中染色体DNA 的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb 的大片段。然后大约30 %的染色体DNA 在Ca2+和 Mg2+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180~200bp核小体DNA多聚体。

 

　　DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的 3'-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL)。

 

　　由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation)，使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。

 

　　TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋广测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。

 

TUNEL细胞凋亡检测服务技术服务介绍
技术服务服务流程
1. 根据客户送的样本（固定好或者包埋好），以及样本类型，安排实验

　　

2.包埋或者切片后，根据客户所测指标，选取合适的一抗.二抗进行制片

　　

3.（可选）根据上述所做好的切片进行拍片

　　

4.（可选）针对做好的玻片进行分析，分析时选取较好的区域，分析三个视野

　　

5.提供实验报告：包括详细的实验方法及实验结果的相关图表

 

　　TUNEL细胞凋亡检测 (TUNEL Apoptosis Assay)是一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB显色等步骤，即可在普通光学显微镜下观察到凋亡细胞。

样本要求：取材保持组织新鲜（组织块以小于2cm×1.5cm×0.3cm为宜），立即放入固定液中（固定液用10%福尔马林液或4%多聚甲quan缓冲液，体积为组织块的10倍以上），避免干燥；对于有血迹的样本，可用PBS液或生理盐水冲洗后直接放入固定液中；经固定后的样本必须在48小时内处理。

　　

实验周期

　　10个工作日内(具体实验周期视实验设计方案而异)

　　

       TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素biotinylate标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的链霉亲和素streptavidin特异性结合，后者又与POD底物H2O2、二氨基联ben胺（DAB）产生深棕色反应，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段.

　

TUNEL细胞凋亡检测服务实验方法

TUNEL 检测对于贴壁细胞或细胞涂片

a.PBS或HBSS洗涤一次。

　　

b.如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。

　

c.用4%多聚甲quan或碧云天生产的免疫染色固定液（P0098）固定细胞30-60分钟。

　　

d.用PBS或HBSS洗涤一次。

　

e.加入含0.1%TritonX-100的PBS，冰浴孵育2分钟。

　　

f.转步骤5。