四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔通用二抗）

组织微环境中有复杂的细胞组成，这些细胞的表型、状态、丰度、分布都有着重要的生物学意义和临床价值。借助抗体染色可以将其在组织原位上呈现出来。免疫组化染色是一种研究组织形态和原位蛋白表达的常见技术，常规IHC检测只能展示单一指标，难以呈现复杂的组织微环境中的细胞组成、状态和关系，而这些信息对疾病的诊断和治疗至关重要！
酪氨信号放大技术原理：类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采用HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，使样品上稳定的共价结合荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的抗体，换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

规格	abs50012（鼠兔）四色多重荧光免疫组化染色试剂盒
	组分	TSA520	TSA570	TSA650	DAPI 100x	信号放大液	HRP标记二抗	抗荧光淬灭封片剂
100T	体积	100μL	100μL	100μL	100μL	30mL	30mL	5mL×2
50T		50μL	50μL	50μL	100μL	15mL	15mL	5mL
20T		20μL	20μL	20μL	100μL	6mL	6mL	5mL

TSA单色荧光染料520、TSA单色荧光染料570、TSA单色荧光染料650、信号放大反应液、鼠兔通用型HRP标记二抗、抗荧光淬灭封片剂、DAPI.

一、样本要求
1、福尔马林固定的蜡块或玻片，大块组织或TMA，封蜡不能有明显的破损。
2、玻片样本，组织需要紧贴玻片，避免褶皱，玻片不能有破损、划伤或污渍。
3、组织最小应包含大于1000个细胞。
4、蜡块需包埋实体瘤组织，坏死瘤组织、细针穿剌物、细胞甩片样品会影响染色效果。
5、组织应当用10%中性福尔马林固定，正常固定时间为18-24h。
6、切片厚度为4μm左右，使用防脱玻片。建议玻片在固定后一周内制备为佳。
7、不要在水浴捞片环节添加任何粘合剂，样本应置于玻片正面、中央。将捞片竖直置于吸水纸上去除水分，轻敲去除水滴，不要用纸擦拭玻片。
8、玻片置于45℃热盘上放置30min（自然风干玻片时长不小于1h）。

二、检验方法
1、所需仪器设备：移液器、恒温干燥箱、微波炉、免疫组化笔、修复杯、染色缸、计时器、孵育湿盒、盖玻片、通风橱、洗瓶、荧光显微镜、量筒100mL、量筒1000mL 等。
2、所需试剂：灭菌去离子水（abs9259）、二甲苯、乙醇（100%、95%、70%）、10%中性福尔马林、抗原修复一抗、封闭液、TBST等。
3、试剂准备：
（1）荧光染料的稀释：染料为100×母液，使用信号放大反应液按1:100稀释制备染料工作液（现用现配）；DAPI使用无菌水按1:100稀释制备工作液。
（2）二抗的使用：试剂盒为鼠兔通用二抗，不建议样本与二抗同源，实验前请核实一抗种属是否匹配。
4、检测设备：荧光显微镜或荧光全片扫描设备，TSA单色荧光染料适用的激发和发射滤光片应符合表中的建议。

三、石蜡切片操作步骤
1、脱蜡水合
（1）新鲜二甲苯浸片10min，重复3次。
（2）梯度乙醇浸片：100% 5min；95% 5min；70% 2min。
（3）灭菌水洗片1min，重复3次。
（4）10%中性福尔马林浸片10-30min，灭菌水洗片1min，重复3次。（可选项，视样本质量而定）
（5）滴加破膜剂通透15min，PBST浸洗3min，重复3次。（可选项，一般情况下可不做）
2、微波修复抗原
（1）将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中，用抗原修复液1×工作液浸没。
（2）将修复杯置于微波炉内高火煮沸。
（3）低火维持15min（注意补液，防止蒸发过度导致干片）。
（4）取出室温自然冷却至室温。
3、淬灭和封闭
（1）去除玻片上残存洗液。
（2）用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加3%过氧化氢覆盖样本区域，孵育10min，PBST浸洗3min，重复3次。
（3）去除玻片上残存洗液，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温保湿震荡10-30min，除去封闭液。
4、一抗孵育
（1）去除玻片上的封闭液。
（2）用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域。
（3）室温保湿震荡孵育1h（需针对不同抗体做优化调整）。
（4）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。
5、二抗孵育
（1）去除玻片上残存的洗液。
（2）直接滴加HRP二抗工作液溶液，浸没样本区域。
（3）室温保湿孵育10min。
（4）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。
6、荧光染色放大信号
（1）去除玻片上残存的洗液。
（2）用移液器在玻片上滴加1×染料工作液100μL（使用信号放大液按1:100稀释）浸没样本区域。
（3）室温保湿震荡孵育10min。
（4）1×TBST buffer浸洗玻片，室温浸片3min。重复3次。
（5）微波修复，室温自然冷却至室温。
（6）灭菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2min。
7、新一轮染色（单染可直接进行第8步）
（1）每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用TBST覆盖样品，防止干片。
（2）封闭：去除玻片上残存洗液，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温保湿震荡10-30min，除去封闭液。（无需淬灭步骤）
（3）重复步骤4-6
（4）多轮染色重复步骤7，（1）—（3）结束后进行染核及封片
8、染核及封片
滴加1×DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育5min。用1×TBST浸洗玻片3次，每次2min。然后滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡，长期保存请用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。
9、阅片，对染色后的组织片在荧光显微镜下观察并分析。

四、冰冻切片操作步骤（需搭配抗体洗脱液abs994）
1、淬灭、通透、封闭
（1）从冰箱中取出冷冻玻片，恢复至室温，PBST浸洗3min，重复3次
（2）10%中性福尔马林浸片10-30min，灭菌水洗片1min，重复3次。（可选项，视样本质量而定）
（3）滴加破膜剂通透15min，PBST浸洗3min，重复3次。（可选项，一般情况下可不做）
（4）用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加3%过氧化氢覆盖样本区域，孵育10min，PBST浸洗3min，重复3次。
（5）去除玻片上残存洗液，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温保湿震荡10-30min，除去封闭液。
2、一抗孵育
（1）去除玻片上的封闭。
（2）用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域。
（3）室温保湿震荡孵育1h（需针对不同抗体做优化调整）。
（4）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。
3、二抗孵育
（1）去除玻片上残存的洗液。
（2）直接滴加HRP二抗工作液溶液，浸没样本区域。
（3）室温保湿孵育10min。
（4）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。
4、荧光染色放大信号
（1）去除玻片上残存的洗液。
（2）用移液器在玻片上滴加1×染料工作液100ul（使用信号放大液按1:100稀释）浸没样本区域。
（3）室温保湿震荡孵育10min。
（4）1×TBST buffer浸洗玻片，室温浸片3min。重复3次。
（5）滴加抗体洗脱液（abs994），37℃孵育15-20min。
（6）灭菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2min。
5、新一轮染色（单染可直接进行第6步）
（1）每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用TBST覆盖样品，防止干片。
（2）封闭：去除玻片上残存洗液，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温保湿震荡10-30min，除去封闭液。
（3）重复步骤2-4。
（4）多轮染色重复步骤5，结束后进行染核及封片。
6、染核及封片
滴加1×DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育5min。用1×TBST浸洗玻片3次，每次2min。然后滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡，长期保存请用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。
7、阅片，对染色后的组织片在荧光显微镜下观察并分析。

五、结果说明：
1、微波修复抗原、孵育时间、温度的改变均有可能得出错误结果。
2、在每次染色过程中，必须有组织阳性对照和试剂阴性对照实验同时进行。
3、若阳性组织对照不能显示阳性染色，则应判定该批次样本的检测结果无效。

六、产品性能指标：
1、符合性：取符合性组织片（包括阳性组织片和阴性试剂对照），经相应的免疫组化试验后，阳性对照染色结果为阳性，阴性对照染色结果为阴性。
2、批内重复性：取同一批次的试剂盒，检测同一组织切片3片，染色结果应一致。
多重荧光免疫组化（mIHC）实验操作演示视频
七、染料信息表格

染料名称	波长		相似荧光染料	推荐颜色设置
	激发波长	发射波长
DAPI	360	461	DAPI
TSA单色荧光染料480	450	480	Opal480/Aqua
TSA单色荧光染料520	490	520	FITC/AF488/Opal520
TSA单色荧光染料540	520	540	AF514/Opal540
TSA单色荧光染料570	550	570	CY3/AF555/Opal570
TSA单色荧光染料620	590	620	AF594/Opal620/TexasRed
TSA单色荧光染料650	630	650	CY5/AF610/Opal650
TSA单色荧光染料690	640	670	AF647/CY5/Opal670
TSA单色荧光染料700	680	702	AF680/CY5.5/Opal690
TSA单色荧光染料770	740	780	CY7/Opal780

八、其他产品推荐

分类	货号	产品名称	规格
固定	abs9179	通用型组织固定液	500mL
包埋（冰冻样本）	abs9756	OCT包埋剂	110mL
抗原修复 （石蜡切片）	abs9342	Tris-EDTA抗原修复液（10×，pH9.0）	100mL
	abs9248	柠檬酸钠抗原修复液（50×）	100mL
抗体洗脱（无法采用热修复进行洗脱的样本，如细胞、冰冻、骨组织等）	abs994	抗体洗脱液（mIHC专用）	30mL
细胞通透 （胞内指标需要）	abs9149	曲拉通X-100	100mL
淬灭内源性过氧化物酶	abs9333	过氧化物酶封闭液（H2O2法）	100mL
	abs9152	吐温-20	500mL/2.5L
封闭 （二抗同来源血清）	abs933	山羊血清	500mL
	abs9157	牛血清白蛋白	100g
一抗	abs1	组化抗体
	abs9299	一抗二抗稀释液	100mL
多色试剂盒 （含有TSA染料、DAPI、封片剂、二抗、信号放大液）	abs50165	七色多重荧光免疫组化染色试剂盒（770染料增强版）（抗兔二抗）	20T/50T/100T
	abs50166	七色多重荧光免疫组化染色试剂盒（770染料增强版）（鼠兔通用二抗）	20T/50T/100T
	abs50015	七色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔通用二抗）	20T/50T/100T
	abs50037	七色多重荧光免疫组化染色试剂盒（plus）（鼠兔通用二抗）	20T/50T/100T
	abs50031	七色多重荧光免疫组化染色试剂盒（抗兔二抗）	20T/50T/100T
	abs50038	七色多重荧光免疫组化染色试剂盒（plus）（抗兔二抗）	20T/50T/100T
	abs50014	六色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔通用二抗）	20T/50T/100T
	abs50049	六色多重荧光免疫组化染色试剂盒（plus）（鼠兔通用二抗）	20T/50T/100T
	abs50030	六色多重荧光免疫组化染色试剂盒（抗兔二抗）	20T/50T/100T
	abs50048	六色多重荧光免疫组化染色试剂盒（plus）（抗兔二抗）	20T/50T/100T
	abs50013	五色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔通用二抗）	20T/50T/100T
	abs50029	五色多重荧光免疫组化染色试剂盒（抗兔二抗）	20T/50T/100T
	abs50012	四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔通用二抗）	20T/50T/100T
	abs50028	四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（抗兔二抗）	20T/50T/100T
	abs50089	三色多重荧光免疫组化试剂盒（鼠兔通用二抗）	100T
	abs50088	三色多重荧光免疫组化试剂盒（抗兔二抗）	100T
	abs50087	双色多重荧光免疫组化试剂盒（鼠兔通用二抗）	100T
	abs50086	双色多重荧光免疫组化试剂盒（抗兔二抗）	100T
肺癌Panel （含一抗）	abs50083	肺癌肿瘤微环境多重荧光免疫组化检测试剂盒（I）	20T
	abs50084	肺癌肿瘤微环境多重荧光免疫组化检测试剂盒（II）	20T
缓冲液	abs952	TBST（10×）	500mL×2
	abs9340	PBST（1×，pH7.4）	500mL
	abs962	PBS缓冲液（1×）	500mL

1、本试剂盒只用于免疫组化，不做其他用途。
2、本试剂盒仅限于专业人员使用。
3、应采用适当的防护措施，以避免试剂同皮肤和眼睛接触。
4、超过有效期的试剂活性可能降低，因此不得使用超过有效期的试剂。
5、若将本试剂盒的染色组分与其他公司的产品混合使用，在染色过程中可能出现异常情况。
6、脱蜡不彻底，容易影响染色效果。
7、为了防止可能出现的假阴性、假阳性结果，实验过程中需有阳性对照及阴性对照同时进行。
8、使用本试剂盒中所产生的各种废弃物都应按照《医疗废物管理条例》进行处理。

1. Mingzhu Yang, et al., Chemical-induced chromatin remodeling reprograms mouse ESCs to totipotent-like stem cells. Cell Stem Cell. 2022 Mar 3
2. Xin Guan, et al., Nanoparticle-enhanced radiotherapy synergizes with PD-L1 blockade to limit post-surgical cancer recurrence and metastasis. Nature Communication. 2022 May 20
3. Qian-Yue Zhang, et al., Lymphocyte infiltration and thyrocyte destruction are driven by stromal and immune cell components in Hashimoto’s thyroiditis. Nature Communications. 2022 Feb 9
4. Dabbs David J. 诊断免疫组织化学(M). 北京：北京大学医学出版社，2008.9.
5. Ed Harlow, David Lane. 抗体技术指南(M). 北京：科学出版社，2002:79-80,105.
6. Stack, E. C., et al. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods, 2014 70 (1): 46-58.
7. 钱帮国. 焦磊. 多标记免疫荧光染色及多普成像技术在组织学研究中的应用. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2017 (4): 373-382.