全血RNA快速提取试剂盒（Dnase I）

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产品描述：

产品名称：全血RNA快速提取试剂盒（Dnase I）

描述: 红细胞裂解液选择性裂解红细胞,然后独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解白细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H20将RNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点：
1、重复性好，柱与柱之间吸附量差异极小。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2、操作安全，不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤.。
3、简便快捷，单个样品操作一般可在40分钟内完成。
自备试剂:β-巯基乙醇、无水乙醇
产品信息：

使用方法: 提示：1、使用前将 10×RLB（RNase-free）用 DEPC 处理水稀释到 1×。2、操作前在裂解液 RLT 中加入β-巯基乙醇至终浓度 1%，如 1 ml RLT 中加入 10 μl β- 巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的 RLT 4℃可放置一个月。操作：1、在适合大小的RNase free离心管中加入1体积（<1.5 ml）加入各种抗凝剂新鲜血液 (颠 倒混匀后)和 3 体积的 1×RLB（RNase free），颠倒混匀，可轻弹管壁,确保混匀。2、室温放置 10 min（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。 如果 RNA 降解严重,可在冰上裂解,但是时间可长一些以充分裂解。3、12,000 rpm 离心 20 sec，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团。如发现红细胞大量残留可重复 2，3 步骤。4、涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬，加 350 μl（<2×10 6白 细胞）或者 600 μl（0.5-1.5 ml 全血或 2×10 6-1×10 7 白细胞）裂解液 RLT，吹打混匀 后用手剧烈振荡 20 sec，充分裂解。5、用带钝针头的一次性 1 ml(配 0.9 mm 针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满 意匀浆结果(或者电动匀浆 30 sec)，可以剪切 DNA，降低粘稠度和提高产量。6、较精确估计裂解物体积，加入等体积的 70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）， 此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。 7、将混合物(每次小于 700 μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱 RA 中（吸附柱放入 收集管中），12,000 rpm 离心 30-60 sec，弃掉废液。8、加 350 μl 去蛋白液 RW1，室温放置 30 sec，12,000 rpm 离心 30 sec，弃掉废液。将吸 附柱 RA 放回收集管中。9、.DNase I 工作液的配制：取 10 μl DNase I 储存液放入新的 RNase-free 离心管中，加入 70 μl RDD 溶液，轻柔混匀。10、向吸附柱 RA 中央加入 80 μl DNase I 工作液，室温放置 15 min（一般情况下室温放 置可得到较好的消化效果，如果室温效果不佳可选择在 37℃放置 15 min）。11、加 350 μl 去蛋白液 RW1，室温放置 30 sec，12,000 rpm 离心 30 sec，弃掉废液。将 吸附柱 RA 放回收集管中。12、加入 500 μl 漂洗液 RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心 30 sec， 弃掉废液。加入 500 μl 漂洗液 RW，重复一遍。13、将吸附柱 RA 放回空收集管中，12,000 rpm 离心 2 min，将吸附柱置于室温放置数分 钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。14、取出吸附柱 RA，放入一个 RNase free 离心管中，根据预期 RNA 产量在吸附膜的中 间部位加 30-50 μl RNase free H2O（事先可在 65℃水浴中加热效果更好），室温放置 1 min，12,000 rpm 离心 1 min。15、如果提取全血>0.5 ml 或者>2x10 6白细胞，加 30-50 μl RNase free H2O 重复步骤 14， 合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍。

储存/保存方法: 参考试剂盒，有效期12个月。

注意事项: 1、第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
2、需要自备一次性注射器。
3、裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮 肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4、关于DNA的微量残留： 由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数 RT-PCR 扩增过程中极其微量的 DNA 残留（一般电泳 EB 染色紫外灯下观察不可见） 影响不是很大，如果要进行严格的 mRNA 表达量分析如荧光定量 PCR，我们建议在进 行模板和引物的选择时：
（1）选用跨内含子的引物，这样 DNA 就不能作为模板参与扩增反应。
（2）选择基因组 DNA 和 cDNA 上扩增的产物大小不一样的引物对。
5、RNA 纯度及浓度检测：
完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度 1.2%；0.5×TBE 电泳缓冲 液；150V，15 min)检测完整性。由于细胞中 70%-80%的 RNA 为 rRNA，电泳后 UV 下应能看到非常明显的 rRNA 条带。动物 rRNA 大小分别约为 5 kb 和 2 kb，分别相当 于 28S 和 18S rRNA。动物 RNA 样品中最大 rRNA 亮度应为次大 rRNA 亮度的 1.5-2.0 倍，否则表示 RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的 RNA，OD260/OD280 读数（10 mMTris, pH7.5）在 1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的 pH 值 影响。同一个 RNA 样品，假定在 10 mM Tris，pH7.5 溶液中测出的 OD260/OD280 读数 1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在 1.5-1.9 之间，但这并不表示 RNA 不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用 RNase-free 水稀释 n 倍，用 RNase-free 水将分光 光度计调零，取稀释液进行 OD260，OD280测定，按照以下公式进行 RNA 浓度的计算： 终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数 n)×40

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