蔗糖磷酸化酶(SP)科研专用测试盒/可见分光光度法

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，裂解葡萄糖苷键，催化葡萄糖基转移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等，合成相应的葡萄糖基低聚糖。此外，SP还能催化氢醌合成熊果苷，具有极强的美白效果，在化妆品工业中具有重要应用。

测定原理：
SP能够以磷酸为受体，催化蔗糖产生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原NADP+生成NADPH，导致340nm光吸收值增加。测定340nm吸光度增加速率，即可计算SP活性。

自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制：
提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体35mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存，临用前加6mL蒸馏水溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存，临用前加12mL蒸馏水水溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min，取上清待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

SP活性计算公式：
1. 按照蛋白浓度计算
酶活定义：37℃，pH6.8时，每毫克蛋白质每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
SP活性（nmol/min/mg prot）=×V反总÷V样÷Cpr÷T=804×△A÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活定义：37℃，pH6.8时，每克样本每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
SP活性（nmol/min/g 鲜重）=×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T=804×△A÷W
3. 按照细胞数量计算
酶活定义：37℃，pH6.8时，每104个细胞每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
SP活性（nmol/min/104 cell）=×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量（万个）)÷T=804×△A÷细胞数量（万个）
：NADPH摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1mL；V样：反应体系中样本体积，0.1mL；W：样本质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2min

注意事项：
1.可选用BCA法测定蛋白含量试剂盒测定蛋白含量。
2.样本较多时，可以按照每个样本试剂一：试剂二：试剂三=600：100：200（μL）的比例配制工作液，用多少配多少，临用前立刻配制，10分钟内使用。